酵母菌高密度發(fā)酵

1、酵母菌的高密度發(fā)酵酵母菌的高密度發(fā)酵發(fā)酵工程發(fā)酵工程課程設(shè)計第四組課程設(shè)計第四組 指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50gDCW（菌體干重）/L以上，理論上的最高值可達200gDCW/L的發(fā)酵方式。 高密度發(fā)酵可以提高發(fā)酵罐內(nèi)的菌體密度，提高產(chǎn)物的細(xì)胞水平量，相應(yīng)的減少了生物反應(yīng)器（發(fā)酵罐）的體積，提高單位體積設(shè)備的生產(chǎn)能力，降低生物量的分離費用，縮短生產(chǎn)周期，從而達到降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率的作用。1.什么是什么是高密度發(fā)酵高密度發(fā)酵 首先首先,因為酵母菌生長繁殖快、代期短因為酵母菌生長繁殖快、代期短,生產(chǎn)生產(chǎn)蛋白的速率為動植物所不能蛋白的速率為動植物所不能比擬比擬 其次其次,酵母菌含有極豐富的

2、蛋白質(zhì)酵母菌含有極豐富的蛋白質(zhì)(45%至至56%),具有人體所必需的八種氨基酸和具有人體所必需的八種氨基酸和B族維生素族維生素,還還擁有豐富的酶系和多種經(jīng)濟價值很高的生理活擁有豐富的酶系和多種經(jīng)濟價值很高的生理活性物質(zhì)性物質(zhì)。 第三第三,酵母菌生產(chǎn)不受季節(jié)、氣候和地區(qū)的酵母菌生產(chǎn)不受季節(jié)、氣候和地區(qū)的限限制制 第四第四,酵母與其他微生物相比酵母與其他微生物相比,具有易于收集具有易于收集,代謝方式多樣性代謝方式多樣性,對環(huán)境的適應(yīng)性較強和人們易對環(huán)境的適應(yīng)性較強和人們易于接受等于接受等特性特性2.2.酵母菌在發(fā)酵工業(yè)方面的優(yōu)勢酵母菌在發(fā)酵工業(yè)方面的優(yōu)勢營養(yǎng)源營養(yǎng)源生長抑制性物質(zhì)生長抑制性物質(zhì)發(fā)酵

3、液流變學(xué)發(fā)酵液流變學(xué)3.3.限制酵母菌高密度發(fā)酵的因素限制酵母菌高密度發(fā)酵的因素 1. 1.營養(yǎng)源營養(yǎng)源 高密度高密度發(fā)酵的生物量達發(fā)酵的生物量達150g/L150g/L到到200g/L200g/L, ,需要投入需要投入2 2倍到倍到5 5倍于生物量的基質(zhì)倍于生物量的基質(zhì), ,加上利用率加上利用率, ,實際用量遠(yuǎn)高實際用量遠(yuǎn)高于此值。于此值。如按葡萄糖計,酵母菌體得率在好氧條件下,葡萄糖的理論值是菌體的2倍,而實用為4倍到10倍;在厭氧條件下,理論值和實用值分別為9倍和60倍到80倍。根據(jù)米氏動力學(xué)理論,當(dāng)營養(yǎng)增加到一定量時當(dāng)營養(yǎng)增加到一定量時( (10ks10ks至至20ks20ks), )

4、,生長顯示飽和型動力學(xué)生長顯示飽和型動力學(xué), ,進一步增加底進一步增加底物濃度物濃度, ,就可能發(fā)生一種基質(zhì)抑制區(qū)就可能發(fā)生一種基質(zhì)抑制區(qū), ,表現(xiàn)為遲滯期延表現(xiàn)為遲滯期延長長, ,比生長速率下降比生長速率下降, ,菌體得率下降。菌體得率下降。對某些常用營養(yǎng)的極限指標(biāo)是銨鹽5g/L,磷酸鹽10g/L,NaCl10g/L至20g/L,乙醇100g/L,葡萄糖100g/L。 由于氧氣在純水中溶解度很大氧氣在純水中溶解度很大,在培養(yǎng)基中在培養(yǎng)基中,溶解度更溶解度更低低,發(fā)酵液中達到30g/L,50g/L,150g/L,其需要使氧傳遞率分別為200mmpl/l.h,375mol/l.h和900mol/

5、l.h,而對現(xiàn)有生物反應(yīng)器的氧傳遞速率上限為300mmol/l.h。因此,溶解氧的供給問題是一個關(guān)鍵限制因素。 酵母菌酵母菌在好氧發(fā)酵中在好氧發(fā)酵中,由于供氧不足、比生長速率由于供氧不足、比生長速率過大或碳源供給量高于酵母菌所能同化的速率過大或碳源供給量高于酵母菌所能同化的速率,就會就會產(chǎn)乙醇等代謝副產(chǎn)物產(chǎn)乙醇等代謝副產(chǎn)物,對菌體生長產(chǎn)生抑制對菌體生長產(chǎn)生抑制。尤其是高密度發(fā)酵,問題更為突出。CO2對菌體生長的影響對菌體生長的影響也不允忽視也不允忽視, ,一般發(fā)酵液中溶解一般發(fā)酵液中溶解7.04%就可抑制酵母就可抑制酵母菌的生長菌的生長,高于高于4%,生長生長下降。下降。發(fā)酵液中CO2的溶解度

6、應(yīng)控制在1%至3%之間。但在大規(guī)模發(fā)酵罐中,CO2的影響將成為一個突出的問題。因為罐中CO2的分壓是液體深度的函數(shù),在罐壓為0.2kg/cm2時,10m高的罐底部的CO2分壓是端的CO2分壓的2倍。2.生長抑制性物質(zhì) 另外,在高密度大規(guī)模發(fā)酵中,大量泡沫的產(chǎn)生和不合理的使用消泡劑也會導(dǎo)致發(fā)酵失敗。酵母菌在生產(chǎn)過程中,分泌一些蛋白質(zhì)等表面性物質(zhì),這些物質(zhì)被相間界面所吸附,導(dǎo)致液體表面張力降低,使單位體積中的相間界面積增大;但表面活性物質(zhì)在相間界面上聚集,超過一定濃度時,使KL劇烈下降。菌體在高密度發(fā)酵時,耗氧速率劇增,更可能使發(fā)酵液內(nèi)的溶氧降到臨界濃度以下。此時,再加消泡劑或再補料,使溶氧濃度在

7、臨界值以下停留了較長時間,導(dǎo)致菌體呼吸停止或厭氧發(fā)酵,并可能造成菌體自溶,產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)和核酸,形成乳化現(xiàn)象。若再加消泡劑就形成惡性循環(huán)。 一般發(fā)酵液視為擬均相,而在高密度發(fā)酵時,不能忽視菌體所占的體積,表現(xiàn)為氣液固三相。另外,高密度發(fā)酵液的粘度也會大幅度增加,表現(xiàn)為非牛頓型流體,對氧的傳遞和營養(yǎng)物的傳質(zhì)都產(chǎn)生較大影響。3.發(fā)酵液流變學(xué)發(fā)酵方式的選擇提高氧的供應(yīng)方法防止乙醇的產(chǎn)生發(fā)酵液流變學(xué)4.4.高密度發(fā)酵的研究進展高密度發(fā)酵的研究進展 4.1發(fā)酵發(fā)酵方式的方式的選擇選擇 為了為了解決高濃度底物抑制解決高濃度底物抑制,補料分批發(fā)酵已被廣泛地補料分批發(fā)酵已被廣泛地應(yīng)用各類微生物的高密度發(fā)酵應(yīng)用

8、各類微生物的高密度發(fā)酵,如Suzuki等(1982年)采用流加所有養(yǎng)料的方法,使酵母菌體濃度可達150g/L以上。他們用多孔特氟隆管式傳感器控制底物乙醇流加。使用質(zhì)量平衡原理配制并流加復(fù)合無機鹽溶液,其流加速度與乙醇和氨水的流加速度相配合。Mori等(1983年)對可同化乙醇的酵母采用補料分批、重復(fù)補料和連續(xù)發(fā)酵三種方式進行了比較,結(jié)果是補料分批發(fā)酵和重復(fù)補料分批發(fā)酵的菌體濃度均在150g/L以上,連續(xù)發(fā)酵的菌體濃度50g/L,而它們的生產(chǎn)率分別為6.97g/L.h.,10.9g/L.h.和10g/L.h.。因此,重復(fù)補料發(fā)酵是經(jīng)濟、有效的高密度發(fā)酵方式 4.2提提高氧的供應(yīng)高氧的供應(yīng)方法方法

9、 為了在高密度發(fā)酵過程中,保持一定的溶氧濃度,現(xiàn)在小型發(fā)酵罐中一般采用同純氧混合通氣來提高氧分壓。由于使用純氧不安全、不經(jīng)濟,同時在大規(guī)模發(fā)酵罐中可能局部混合不均,易使微生物產(chǎn)生氧中毒,反而抑制了菌體生長。最近已開發(fā)了多種提高氧供應(yīng)的方法,如通過提高發(fā)酵罐的壓力來提高氧的分壓通過提高發(fā)酵罐的壓力來提高氧的分壓,ICI公司的壓力循環(huán)罐已試驗成功。在培養(yǎng)液中添加過在培養(yǎng)液中添加過氧化氫氧化氫,在細(xì)胞過氧化氫酶的作用下在細(xì)胞過氧化氫酶的作用下,釋放出氧氣釋放出氧氣,供菌供菌體體使用。使用。有人采用和小球藻混合培養(yǎng)方法,使藻細(xì)胞進行光合作用,所產(chǎn)生的氧氣直接供菌體吸收。在培在培養(yǎng)基中添加血紅蛋白或氟化

10、物乳劑養(yǎng)基中添加血紅蛋白或氟化物乳劑,將其作為氧氣載將其作為氧氣載體體,提高培養(yǎng)基中氧的含量提高培養(yǎng)基中氧的含量,在培養(yǎng)基中添加在培養(yǎng)基中添加75%氟化氟化物乳劑物乳劑,發(fā)酵發(fā)酵24h,酵母菌體可達酵母菌體可達155g/L 4.34.3防止防止乙醇的乙醇的產(chǎn)生產(chǎn)生 早在巴斯德時代,人們已知道大量通風(fēng)不產(chǎn)生乙醇,并且采用了補料技術(shù)(1915年)。但由于酵母菌的乙醇發(fā)酵酶系是組成酶,不受其他影響,而其呼吸酶系是阻遏酶系,受其他條件影響較大。Crabtrec效應(yīng)就是指在高糖濃度下,即使在有氧條件下,使菌體由呼吸型向發(fā)酵型轉(zhuǎn)變,也就是高速率同化葡萄糖而引起的好氧呼吸的阻遏作用。一般產(chǎn)生乙醇的條件是菌體比生長速率過高時,即使葡萄糖濃度保持在較低水平,酵母菌仍可轉(zhuǎn)化為發(fā)酵性代謝,從而使菌體產(chǎn)量下降;或者供給糖量高于酵母菌所能同化的速率,即使供氧充分,仍然產(chǎn)生乙醇。為了防止乙醇產(chǎn)生,一般采用保持一定的比生長速率,采用補料技術(shù),充分通風(fēng),使所產(chǎn)生的乙醇為酵母菌再利用。近年來興起的生物反應(yīng)和分離耦合技術(shù)在高密度發(fā)酵中的應(yīng)用已取得了很大進展。乙醇作為副產(chǎn)物被在位分離出去。另外,對于CO2的有效去除,主要考慮設(shè)備選型和操作技巧問題。而消泡劑的