HPLC和E衍生試劑

1、 液相色譜和毛細管電泳中的衍生試劑 為什么衍生 衍生方式 衍生試劑的構(gòu)成與要求 衍生試劑 種類及應(yīng)用液相色譜和毛細管電泳中的衍生試劑為什么衍生 檢測方法與檢測信號 化學(xué)衍生主要是用于改善檢測靈敏度 不好線性檢測或較窄線性范圍檢測和高檢出限的分析物，通過衍生得到改善 不能與其它基體物質(zhì)分辨的分析物，通過衍生可以擴大差別 熒光生成（fluorogenic）試劑和熒光標記（fluorescent label）試劑. 衍生反應(yīng)方式 柱前衍生（pre-column derivatizations） 柱后衍生（post- column derivatizations) 柱中衍生 （on column de

2、rivatizations) 離線（off line)柱前衍生 在線（on line)柱前衍生， 離線（off line)柱后衍生 在線柱后衍生柱前衍生 自由性大 衍生與柱分離的流動相無關(guān) 提高檢測靈敏度 改善分離方法選擇性和色譜分辨率 易于優(yōu)化反應(yīng)條件 衍生物穩(wěn)定 產(chǎn)率高 副反應(yīng)產(chǎn)物少 選擇易與色譜流動相混合的溶劑作為衍生溶劑 在線柱后衍生 柱后反應(yīng)器 衍生反應(yīng)不強調(diào)生成單一的穩(wěn)定的衍生產(chǎn)物 過量的衍生試劑干擾檢測 要求快速并允許現(xiàn)時檢測 加泵供給衍生試劑 反應(yīng)溶劑必須與分離用的流動相易混溶 衍生試劑與柱淋洗液有效混合柱中衍生 這一衍生方法基本是把衍生試劑溶入流動相，注射樣品后，在柱上分析物

3、與流動相中的衍生試劑反應(yīng) 方法適于不太穩(wěn)定的衍生物，反應(yīng)要快 所需衍生試劑量較大，昂貴的衍生試劑不應(yīng)采用此法. 衍生試劑的構(gòu)成與要求 衍生試劑必須含有可檢測的基團，即顯色團（chromophore）、熒光團（fluorophore）和電基團（electrophore） 含有反應(yīng)基團如fitc nsch3och3oncsnoocoohoooch2coo 衍生試劑穩(wěn)定 要純，不含雜質(zhì)， 形成一種衍生物，盡可能沒有副產(chǎn)物形成 盡可能高衍生物產(chǎn)率； 需衍生試劑盡少，避免試劑峰的干擾. 對于柱后衍生試劑，同樣須具有的共同條件外，應(yīng)：（1）試劑與被分析物反應(yīng)迅速；（2）衍生試劑轉(zhuǎn)化率高，過量少，以免干擾衍

4、生物的檢測.進展文獻鄧櫻花，王紅，張華山，高效液相色譜和毛細管電泳分離熒光檢測小分子氨基生物物質(zhì)的進展 ，分析科學(xué)學(xué)報，2010，26（1）：103衍生試劑 種類與應(yīng)用 胺的衍生試劑 巰基的衍生試劑 羥基的衍生試劑 羰基化合物的衍生試劑 羧酸的衍生試劑 分離對映體的手性衍生試劑 被衍生的氨基化合物 氨基酸 神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸 谷氨酸(glu)、天冬氨酸(asp)、-氨基丁酸(gaba)、甘氨酸(gly)、-丙氨酸(-ala)、?；撬?tau)等 神經(jīng)遞質(zhì) 多巴胺、腎上腺素、去甲基腎上腺素 小肽和肽段 二甘肽，三甘肽，谷胱甘肽，腦啡肽等 磷酸化氨基酸 磷酸化絲氨酸(p-ser)、磷酸化蘇氨酸(p-t

5、hr)和磷酸化酪氨酸 脂肪胺 生物胺 腐胺、尸胺、精胺、亞精胺 蛋白質(zhì)胺的衍生試劑 芳香鄰二醛類 異硫氰酸酯類 酰氯類 羰酰氯類 磺酰氯 活性鹵類 n-羥基琥珀酰亞胺活性酯類 其它芳香鄰二醛類 opa、2，3-萘二醛（nda）、3-（2-呋喃甲酰基）-喹啉-2-羰醛（fqca）、3-（4-羧基苯甲酰基）-喹啉-2-羰醛（cbqca）.choconcoohchochochochochochornh21rsh2nsr2r1+chochocn-rnh2ncnr+choconcooh-cnncoohcnnr+nh2rfig.1-2. typical electropherogram of a 500

6、nl aliquot of derivatized microdialysate from the rat striatum. the separation buffer was 75 mm borate buffer (ph 9.2) containing 70 mm sds and 10 mm hp-cd. is was cysteic acid. he-cd 激光器electrophoresis 2003, 24, 318731962, 3-萘二醛萘二醛(nda)衍生衍生ce-lif分離檢測分離檢測活體中的活體中的gaba、glu、l-asp檢測限: 0.6-3 nm .異硫氰酸酯類 苯

7、異硫氰酸酯（pitc） coohchrnh2ncsnhcnhscoohrchnnhchospitc ptc-氨基酸 pth氨基酸 edman試劑 紫外檢測 254nm 衍生物穩(wěn)定，分析時間也較短 副產(chǎn)物、溶劑等多種干擾因素可通過高效蒸發(fā)除去,較煩瑣 30min內(nèi)分離20余種氨基酸 nnnncs2( )ch34-n，n-對二甲胺基偶氮苯-4-異硫氰酸酯（dabitc ）nsch3och3oncs4-（5，6-二甲氧基苯并噻唑）苯異硫氰酸酯 熒光素異硫氰酸酯（fitc） j. chromatogr. b, 2001, 758, 277-282 fig. 1-1. electropherogram

8、of standard amino acids (each amino acids concentration: 2.510-8 m). (1)arg, (2) lys, (3) gln (4) gaba, (5)ala, (6) gly, (7) glu, (8) asp, (a) fitc, (b) decomposition products of fitc.下丘腦的神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸在運動中樞神經(jīng)中起著重要作用熒光素異硫氰酸酯熒光素異硫氰酸酯(fitc)衍生衍生ce-lif分離分離測定大鼠下丘腦中的八種氨基酸測定大鼠下丘腦中的八種氨基酸衍生條件：ph 10 硼砂緩沖溶液, 室溫, 避光17

9、 hfig. 1-3. typical chromatogram of sifa derivatives with amines.mobile phase: methanolwater (46/54, v/v) solution containing10 mmol/l ph 5.40 citric acidna2hpo4 buffer; amine concentration: 0.1 mmol/l; fluorescence detection wavelengths: ex/em = 488/516 nm. (1) methylamine (2) ethylamine (3) ethyle

10、ne diamine (4) foaa (hydrolyzed product of sifa) (5) isopropylamine (6) isobutylamine (7) n-butylamine (8)1,4-butylene diamine (9) 1,5-amylene diamine. reprinted from ref.197 酰氯類 磺酰氯類（-so2cl） 和羰酰氯（-cocl）so2cln()2ch3nso2()ch3 2hnr2nr2r2hnoch2r2ncoch2ococl丹磺酰氯 dns-cl. 5-二甲氨基-1-萘磺酰氯，熔點69-71oc 激發(fā)波長350nm

11、，發(fā)射波長530nm. 衍生反應(yīng)所30min到2h 非水溶液衍生時間較短 衍生物產(chǎn)率受介質(zhì)ph值和水的含量影響 穩(wěn)定12-24h，對紫外光比較敏感，衍生反應(yīng)須避光進行，衍生物要避光存放. 測定了22種氨基酸并用于人體血漿樣品，檢測限1.0pmol 紫外檢測，靈敏度低，檢出限僅50-100pmol. ods柱（1254.6mm，3m）；流動相：a，3%四氫呋喃的15mmol/l磷酸鈉緩沖溶液（ph6.3）；b，60%乙晴的15mmol/l磷酸鈉緩沖溶液（ph6.3）；梯度淋洗；柱溫，25oc，熒光檢測，ex330nm，em550nm其它磺酰氯衍生試劑 p-4，4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯（dabs-

12、cl） 5，5-二丁氨基-1-萘磺酰氯（bns-cl） n-甲基-2-苯胺基萘-6-磺酰氯 4-萘-1-偶氮-（4-二甲氨基苯）磺酰氯 香豆素-6-磺酰氯（c-6-so2cl） 羰酰氯 9 - 芴 甲 基 氯 甲 酸 酯 ， 9 - 芴 甲 氧 基 羰 酰 氯（fmoc-cl） ex265nm，em310nm 在室溫和堿性條件下，衍生反應(yīng)30s完成.衍生產(chǎn)物很穩(wěn)定 二元梯度淋洗，23min分離了22種生理氨基酸 檢出限1.0pmol 測定地下水中的二甲基胺64和法國紅酒中組胺、精胺等生物胺 fmoc-cl的水解產(chǎn)物有相似的熒光強度，上柱分離前須除去，戊烷萃取 superspherch-8（12

13、54.0mm）；流動相：a，20%乙晴的50mmol/l乙酸鈉緩沖溶液（ph4.2）；b，70%乙晴的50mmol/l乙酸鈉緩沖溶液（ph4.2）；梯度淋洗；柱溫，35oc，熒光檢測，ex265nm，em310nm fig.1-1comparison of separation of 5 fmoc-cl derivatized neurotransmitter amino acids in n-mekc and rm-mekc with reversed migration elution order. sample: a neurotransmitter amino acid standar

14、d. separation conditions, background electrolyte, 60 mmol/l boric acid-naoh (ph 8.60), 40 mmol/l sds; capillary 55 cm (47 cm to detector window)350 mm i.d., (a) uncoated capillary,125 kv, 24 ma; (b) coated capillary, 225 kv, 24 ma. sample concentration, 200 mmol/l; injection; 50 mbar, 10 s. reprinte

15、d from ref. 107. nnch3och3och3ococl3，4-二氫-6，7-二甲氧基4-甲基-3-喹惡啉-2-羰酰氯（dmmqc-cl） nch3ococlso2ch36-甲氧基-2-甲基磺酰-喹啉-4-羰酰氯 （msqc-cl） ch2och2coclch2cocloch2活性鹵類 可與一、二級胺反應(yīng)nnorxnnorx nbd-cl作為熒光生成試劑用于衍生脂肪胺及氨基酸在弱堿性溶液中進行 nbd-cl是一個選擇性相當好的衍生試劑，雖然它也與醇（-oh）、硫酚（-sh）和苯胺反應(yīng) 衍生物的熒光強度比脂肪胺低很多 衍生物顯示出激發(fā)波長最大在480nm，適合ar離子激發(fā)波長 nb

16、d-f與氨基乙酸的反應(yīng)速度比nbd-cl快500倍在ph8.0、60oc及避光 5min內(nèi)就與氨基酸完成反應(yīng). 手性柱上氨基酸對映體的分離. nbd-cl與二級氨基酸反應(yīng)的活性更好. nbd-胺結(jié)合物在水中的熒光量子產(chǎn)率很低，小于0.01；而在甲醇溶液中大大增加. dbd-f在ph8.0和50oc，反應(yīng)2h，dbd-f與氨基化合物同樣生成衍生物，用于反相色譜分離氨基酸和脂肪胺類，激發(fā)波長466-469nm，檢測發(fā)射波長594-600nm，檢出限亞pmol級 abd-f的胺衍生物的激發(fā)和發(fā)射波長紫移，分別為450nm和590nm；熒光強度低2.5倍. 2，4-二硝基氟苯是在紫外光區(qū)有吸收峰的含活

17、性鹵原子的hplc分離氨基酸的柱前衍生試劑,400nm 在溫和條件（ph8-9，室溫）與一、二級氨基酸均能反應(yīng)，衍生物穩(wěn)定 紫外檢測，靈敏度較低，多應(yīng)用于測定蛋白質(zhì)的n-末端氨基酸殘基 n-羥基琥珀酰亞胺活性酯類 氨基甲酸酯類（aqc）和羧酸酯（siia） noonoo2rnh2h o+coonch2hoconch2nhrohcoonch2noohosiia+nnhcoonoo2h oco2nnhconnhconnh22rnhnoohonooho+nhraqcnoocoohoooch2coo+(c h )252ncnoch2ch3noonoo 熒光素-o-乙酸酯（fl-o-ac-se )9-氰

18、基-n，n，n，-三乙基-n-（5-琥珀酰亞胺氧羰基戊基）焦寧氯化物（pyronin se）近紅外的活性酯熒光衍生試劑，em=695nm，衍生氨基酸，ce分離，激光誘導(dǎo)熒光檢測限達0.8-4.5amol琥珀酰亞胺-4，4二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸酯（bodipy-c3-se） noonnbffch3ch3ch2occh2onoonhcoo琥珀酰亞胺-9-芴甲氧基甲酸酯（fmoc-se） noonch2coonoonooch2cooch2conoofig. 1-3. electropherograms obtained for separati

19、ons of five dtaf labeling phosphoamino and amino acids in ph 9.3 borate buffer10mm brij35. separation voltage: 25 kv; injection: 50 mbar for 3 s; analyate concentrations: 1 m; peaks: (1) glu, (2) asp, (3) p-tyr, (4) p-thr, (5) p-ser.5-(4,6-二氯二氯-s-三嗪三嗪-2-氨基氨基)熒光素熒光素(dtaf)標記標記ce-lif檢測磷酸化氨基酸檢測磷酸化氨基酸j.

20、chromatogr. a, 2004, 1049, 237242線性范圍: 0.01-1 m 檢測限: 0.5-2 nm 圖1-4是固定fitc-bsa和bsa抗體的濃度，加入不同量的bsa的示意圖。隨著bsa濃度不斷的增加，游離的fitc-bsa峰不斷升高，而fitc標記的抗原抗體復(fù)合物的峰不斷降低，甚至消失 fig.1-4 comparison of electropherograms of competitive ceia due to adsorption of the analyte to the capillary wall with whole anti-bsa. the re

21、action mixtures contained fitc-bsa(300 nmol/l), anti-bsa (333 nmol/l) and bsa solution in different concentrations. buffer, 200 mmol/l borate, ph 8.5. applied voltage, 25 kv; 3 s injection; lif detection. reprinted from 252. 茚三酮 h o2oooooohohchnh2coohroooohnco2rcho+-() 茚三酮 水合茚三酮 藍紫色化合物最大吸收峰570nm. 熒光胺，又叫熒胺，它本身沒有熒光，它可與一、二級胺反應(yīng)，ex=400nm，em=485nm 在室溫，ph.9.0，熒光胺與胺衍生反應(yīng)1s中即可完成，過量試劑幾秒內(nèi)就水解為無熒光的產(chǎn)物 無熒光的二級胺衍生物可在一定條件下再與一級胺反應(yīng)，同樣能形成一個綠-藍色熒光的產(chǎn)物 oooocoohohno-rrnh2nhrrcoohoonrrr-nh