創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目研究報(bào)告總結(jié)

1、特殊磷脂酶產(chǎn)生菌的篩選研究總結(jié)報(bào)告摘要：磷脂酶A1是專一水解天然磷脂sn一1位?；拿福梢缘玫絊n-2基溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶在商業(yè)上可用于在煉油過程(油脫膠)磷脂的去除。本研究從土樣采集環(huán)節(jié)即針對(duì)磷脂酶酶的特點(diǎn)，選擇特異性生境（油菜、花生等富含脂質(zhì)的根際土壤或豆腐乳等）進(jìn)行土壤采集，依據(jù)細(xì)菌、放線菌、真菌的特點(diǎn)分別設(shè)置適宜的培養(yǎng)條件進(jìn)行目標(biāo)菌株篩選，并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫顯色法建立篩選模型，對(duì)初篩性能優(yōu)秀的菌株，進(jìn)行復(fù)篩。關(guān)鍵詞：磷脂酶A1；初篩；復(fù)篩；GPC引言磷脂酶是脂肪酶的一種，同時(shí)具有脂肪酶活性和磷脂酶活性，但是在一定的反應(yīng)體系中，會(huì)優(yōu)先表現(xiàn)出一種特定的酶活，磷脂酶可以催

2、化酯交換、酯轉(zhuǎn)移、水解等反應(yīng)，對(duì)磷脂的結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種改變或修飾，得到不同結(jié)構(gòu)和用途的磷脂，所以在油脂工業(yè)中廣泛應(yīng)用。磷脂酶A1(PLA1，EC 31132)催化磷脂第一位酯酰鍵的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸，在工業(yè)上主要用于食品和非食品的磷脂乳化劑的修飾，增加油水混合物的乳化以及植物油脫膠等。同傳統(tǒng)的脫膠方法相比，酶法脫膠可大大節(jié)約化學(xué)物質(zhì)的消耗量，幾乎不產(chǎn)生廢水，是一種經(jīng)濟(jì)節(jié)約、高效穩(wěn)定、綠色環(huán)保的具有國際領(lǐng)先水平的油脂脫膠方法。PLA1在烘焙應(yīng)用中對(duì)于提高生面團(tuán)或烘焙產(chǎn)品質(zhì)量特別有用。此外，PLA1水解卵磷脂的產(chǎn)物甘油磷酸膽堿具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞機(jī)制的生理功能，因而引起人們特殊的研究興趣。本研究從

3、土樣采集環(huán)節(jié)即針對(duì)磷脂酶酶的特點(diǎn)，選擇特異性生境（大豆、油菜、花生等富含脂質(zhì)的根際土壤或煉油廠周邊的土壤）進(jìn)行土壤采集，依據(jù)細(xì)菌、放線菌、真菌的特點(diǎn)分別設(shè)置適宜的培養(yǎng)條件進(jìn)行目標(biāo)菌株篩選，并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫顯色法建立篩選模型，對(duì)初篩性能優(yōu)秀的菌株，模擬實(shí)際生產(chǎn)過程，用非水相反應(yīng)體系進(jìn)行復(fù)篩。1.土樣的采取針對(duì)磷脂酶的特點(diǎn)，為了提高獲得磷脂酶的可能性，我們組采用的是花生地，菜園地，油菜地的土壤以及豆腐乳來做篩選。以下是我們組做過的土壤及數(shù)量：花生地土壤一份菜園地土壤兩份油菜地土壤兩份（混合在一起做的）豆腐乳三塊2.菌株的分離純化2.1 培養(yǎng)基的制備NA（分離細(xì)菌：加入放線菌酮以抑制真

4、菌生長）：(w/v)牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.0%，NaCl 0.5 %，瓊脂 2.0%，pH 7.2；高氏一號(hào)（分離放線菌：加入放線菌酮以抑制真菌生長）：(w/v) KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 %，瓊脂 2.0%，pH 7.2；PDA（分離真菌：加入青霉素以抑制細(xì)菌生長）：(w/v)馬鈴薯20.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%；(注：因?yàn)橥炼古囵B(yǎng)基的制備比較麻煩，后面我們使用的是買來的孟加拉紅培養(yǎng)基）2.2 分離純化結(jié)果土壤分類數(shù)量注釋說

5、明花生地細(xì)菌32株真菌培養(yǎng)基被長毛的真菌覆蓋，導(dǎo)致分離困難；并且初次實(shí)驗(yàn)沒有經(jīng)驗(yàn)，分離的菌株沒有保存。放線菌27株真菌19株菜園地土壤（細(xì)菌）51株文獻(xiàn)表明產(chǎn)生菌多為細(xì)菌，并且我們操作還不夠嫻熟，所以只分離了細(xì)菌土壤（細(xì)菌）49株油菜地細(xì)菌32株 3月份采取的土壤，天氣還比較寒冷，所以菌的數(shù)量比較少；真菌幾乎沒有 放線菌17株 真菌13株豆腐乳（三塊）細(xì)菌3株豆腐乳只長出了細(xì)菌，并且細(xì)菌的形態(tài)都一樣，所以每塊豆腐乳取了一個(gè)細(xì)菌放線菌分離純化圖片細(xì)菌分離純化圖片真菌分離純化圖片 3.產(chǎn)生菌的初篩3.1初篩第一步將純化的待篩菌株接種于篩選培養(yǎng)基上（原培養(yǎng)基的碳源和氮源均改為大豆卵磷脂），培養(yǎng)基配方

6、如下： 細(xì)菌篩選培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，瓊脂 2.0%，pH 7.2；放線菌篩選培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 %，瓊脂 2.0%，pH 7.2；真菌篩選培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4&

7、#183;3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，瓊脂 2.0%，pH 7.2；初篩第一步結(jié)果如下：產(chǎn)生菌來源分類數(shù)量注釋說明花生地細(xì)菌16株真菌和放線菌丟失菜園地土壤（細(xì)菌）21株土壤（細(xì)菌）23株油菜地+豆腐乳細(xì)菌19株放線菌幾乎都可以在初篩平板上生長放線菌16株真菌8株細(xì)菌初篩平板真菌初篩平板放線菌初篩平板3.2 初篩第二步再將初篩第一步長出的菌株接種于將含有溴甲酚紫的初篩平板培養(yǎng)，由于脂肪酸與溴甲酚紫（溴甲酚紫變色范圍的pH值為5.2-6.8）反應(yīng)形成黃色的透明圈，通過有無透明圈可以判斷菌株在分解卵磷脂時(shí)有無產(chǎn)生副產(chǎn)物脂肪酸。培養(yǎng)基配方如

8、下：細(xì)菌篩選培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，瓊脂 2.0%，溴甲酚紫1%,pH 7.2；放線菌篩選培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 %,瓊脂 2.0%，溴甲酚紫1%，pH 7.2；真菌篩選培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.

9、05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，溴甲酚紫1%，瓊脂 2.0%，pH 7.2；初篩第二步結(jié)果如下：產(chǎn)生菌來源分類數(shù)量花生地細(xì)菌7株菜園地土壤（細(xì)菌）7株土壤（細(xì)菌）14株油菜地+豆腐乳細(xì)菌9株放線菌8株細(xì)菌含溴甲酚紫的篩選平板放線菌含溴甲酚紫的初篩平板3.產(chǎn)生菌的復(fù)篩（難點(diǎn)）3.1 發(fā)酵（1）液體培養(yǎng)基的制備，每瓶大概100ml左右，具體配方如下：細(xì)菌液體培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，p

10、H 7.2；放線菌液體培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 %，pH 7.2；真菌液體培養(yǎng)基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，pH 7.2；（2） 接入菌株，放入搖床恒溫發(fā)酵（3） 發(fā)酵液離心，去上清液（胞外酶）注：剛開始老師要求

11、我們不僅要做胞外酶還要做胞內(nèi)酶，所以還需要用清水洗滌細(xì)胞沉淀兩次，然后用超聲波進(jìn)行破碎。3.2 反應(yīng)體系的構(gòu)建特注：由于實(shí)驗(yàn)室并沒有可以讓我們用來復(fù)篩的成熟方法，所以產(chǎn)生菌的復(fù)篩工作是我們此次創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)。以下描述體現(xiàn)的是我們組摸索成熟復(fù)篩方法的過程：方法一（2014年11月至12月）：A.底物的配制：2.0g卵磷脂:6.3ml異辛烷:0.9ml正丁醇B.微乳體系的構(gòu)建反應(yīng)組： 4ml底物+600µl發(fā)酵液陰性對(duì)照：4ml底物+600µl緩沖液（ph=4的緩沖液）陽性對(duì)照：4ml底物+200µl標(biāo)準(zhǔn)酶液+400µl緩沖液將裝有反應(yīng)液的塑料管放入5525

12、0rpm搖床中16h（注意每次反應(yīng)時(shí)間保持一致） C.取樣點(diǎn)板(1)由于反應(yīng)液比較粘稠，用毛細(xì)管點(diǎn)不上，所以對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行了如下處理：取小離心管，每只分別加入200µl反應(yīng)液+400µl甲醇+400µl蒸餾水，搖勻5min后，然后離心5min，取下清液點(diǎn)板。(2) 我們使用的是GF254硅膠板，每個(gè)板上除了點(diǎn)上反應(yīng)組之外，還需點(diǎn)上陽性組，陰性組和GPC標(biāo)準(zhǔn)，點(diǎn)完后用吹風(fēng)機(jī)吹干D展開展開劑：將點(diǎn)好的板放入展開劑中，注意展開劑不能沒過板上的點(diǎn)。待展開劑爬到頂端，取出硅膠板吹干后放入碘缸染色15min,觀察結(jié)果。結(jié)果：該方法反應(yīng)結(jié)果不太理想，我們嘗試著用其他的方法方法二（

13、2015年3月至4月）：A.底物的配制：10g卵磷脂：100ml水B.乳化體系的構(gòu)建反應(yīng)組： 2ml底物+30ml發(fā)酵液陰性對(duì)照：2ml底物+未接菌種的發(fā)酵液陽性對(duì)照：2ml底物+30ml水+200µl標(biāo)準(zhǔn)酶液上述放55,250rpm搖床16hC.取樣點(diǎn)板展開這次我們使用的展開劑是氨水（5mol/l)和正丙醇，但是比例還需要調(diào)整，我們?cè)囼?yàn)了以下比例：氨水（5mol/l)：正丙醇=1:9氨水（5mol/l)：正丙醇=3：7氨水（5mol/l)：正丙醇=2:8氨水（5mol/l)：正丙醇=7:13經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)比例為3:7的效果最好。4. 實(shí)驗(yàn)總結(jié)4.1實(shí)驗(yàn)小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)中我們共處理了8份土

14、樣（包括三塊豆腐乳），分離純化了167株細(xì)菌、44株放線菌、32株真菌。第一步初篩得到了79株細(xì)菌、16株放線菌、8株真菌；第二步初篩得到了24株細(xì)菌、9株放線菌、8株真菌。通過對(duì)以上的41株菌株的復(fù)篩，最終確定菌株LE-1是我們所需要的菌株。下圖中LE-1和對(duì)照的陽性菌產(chǎn)生了相同的點(diǎn)，而與之對(duì)應(yīng)的陰性菌沒有，我們可以初步判斷LE_1是我們所需要的特殊磷脂酶產(chǎn)生菌。4.2菌株LE-1生理生化研究 （1)下圖是菌株LE-1的電鏡圖片，菌絲寬706nm，孢子直徑為1.36µm。菌株LE-1的電鏡圖片（2）通過革蘭氏染色以及甲基紅實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)可知菌株LE-1是革蘭氏陽性菌革蘭氏染色甲基紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果 V-P實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.實(shí)驗(yàn)中的困難與建議本實(shí)驗(yàn)中最大的困難就是復(fù)篩方法的確定，開始我們使用的是微乳體系和組成為的展開劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想。后來我們開始調(diào)整體系為乳化體系，展開劑為氨水（5mol/l)和正丙醇，但是二者的比例仍需我們?cè)囼?yàn)摸索，最后確定氨水（5mol/l)：正丙醇=7:13時(shí)的效果最好。由于時(shí)間有限，方法還存在很多不足，仍然有許多不完善的的地方需要我們改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)所有的操作主要是在昇華樓6