2019年生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與保藏

1、生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與保藏目前工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐容積已達(dá)到幾十立方米或幾百立方米。如按百分之十左 右的種子量計(jì)算，就要投入幾立方米或幾十立方米的種子。要從保藏在試管中的微 生物菌種逐級(jí)擴(kuò)大為生產(chǎn)用種子是一個(gè)由實(shí)驗(yàn)室制備到車間生產(chǎn)的過程。其生產(chǎn)方 法與條件隨不同的生產(chǎn)品種和菌種種類而異。如細(xì)菌、酵母菌、放線菌或霉菌生長(zhǎng) 的快慢；產(chǎn)抱子能力的大??；及對(duì)營(yíng)養(yǎng)、溫度、需氧等條件的要求均有所不同。因 此，種子擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)根據(jù)菌種的生理特性，選擇合適的培養(yǎng)條件來(lái)獲得代謝旺盛、 數(shù)量足夠的種子。這種種子接入發(fā)酵罐后，將使發(fā)酵生產(chǎn)周期縮短，設(shè)備利用率提 高。種子液質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵性的作用。種子擴(kuò)大培養(yǎng)：

2、是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種 接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和 質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件：(1) 菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，遲緩期短；(2) 生理形狀穩(wěn)定；(3) 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；(4) 無(wú)雜菌污染；(5) 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。第一節(jié)種子的制備過程在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，種子制備的過程大致可分為兩個(gè)階段:(1) 實(shí)驗(yàn)室種子制備階段(2) 生產(chǎn)車間種子制備階段-輕宅種子制螯聲盤一t生產(chǎn)卒間芒于貼魯脫段U $7 種子擴(kuò)大堆希澆鉉圖1 一

3、砂土制冋?qǐng)R一衿旅二康甩刊3軸面疤子川一搖瓶浪體繪刑碣軟體)； 茹于瓶期新堆養(yǎng)；零亠固體培并基站養(yǎng)汕“一雅子器培養(yǎng)；0 S；酵蔬一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式： 對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng) 孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡(jiǎn)便，不易污染雜菌。對(duì)于產(chǎn)孢子 能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。（一）孢子的制備1，細(xì)菌孢子的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37C。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般為 12 天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要 510天。2，霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、 小米、玉米

4、、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。 培養(yǎng)的溫度一般為2528°C。培養(yǎng)時(shí)間一般為414天。3，放線菌孢子的制備 放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營(yíng)養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無(wú)機(jī)鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28C。培養(yǎng)時(shí)間為 514天。（二）液體種子制備1 ，好氧培養(yǎng)對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S. Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。 將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為 種子。其過程如下：試管f三角瓶f搖床f種子罐

5、2，厭氧培養(yǎng)對(duì)于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） ，其種子的制備過程如下：試管f三角瓶f卡式罐f種子罐例如生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或 MYPG 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配制： 3 克麥芽浸出物， 3 克酵母浸出物， 5 克蛋白胨， 10 克葡萄糖和 20 克瓊脂與升水中） 的斜面上，于4C冰箱內(nèi)保藏。每年移種3-4次。將保存的酵母菌種接入含10ml麥 芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25C培養(yǎng)2-3天后，再擴(kuò)大至含有 250-500ml 麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25C培養(yǎng)2天后，移種至含有5-10L麥芽汁 的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20C培養(yǎng)3-5天即可作100L麥芽汁

6、的發(fā)酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間，均需定時(shí)搖動(dòng)或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利 與酵母菌的增殖二、生產(chǎn)車間種子制備實(shí)驗(yàn)室制備的抱子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不 同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如 果是需氧菌，同時(shí)還需供給足夠的無(wú)菌空氣，并不斷攪拌，使菌(絲)體在培養(yǎng)液 中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。1, 種子罐的作用：主要是使抱子發(fā)芽，生長(zhǎng)繁殖成菌(絲)體，接入發(fā)酵罐能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一 定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。2, 種子罐級(jí)數(shù)的確定種子罐級(jí)數(shù)：是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：(1) 菌種生長(zhǎng)特性、抱子

7、發(fā)芽及菌體繁殖速度；(2) 所采用發(fā)酵罐的容積。比如：細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。茄子瓶-種子罐-發(fā)酵罐霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵抱子懸浮液-一級(jí)種子罐(27C,40小時(shí)抱子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲)-二級(jí)種子罐 (27C, 1024小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體)-發(fā)酵罐放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子3，確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的冋題(1) 種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì)(2) 種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染 菌機(jī)會(huì)(3) 雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。 但也與所

8、選用工藝條件有 關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了抱子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種 子罐的級(jí)數(shù)。第二節(jié)種子質(zhì)量的控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制影響抱子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間等。A 嚴(yán)去甘 1，培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)。 例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)抱子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品 種、加工方法及用量的不同對(duì)抱子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨 或骨胨對(duì)抱子影響也不同。原材料質(zhì)量的波動(dòng)，起它要作用的是其中無(wú)機(jī)離子含量 不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激抱子的形成。磷含量太

9、多或太少也會(huì) 影響抱子的質(zhì)量。水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動(dòng)，影響種子 質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的 菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。解決措施：(1) 培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用；(2) 嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；(3) 斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間；(4) 供生產(chǎn)用的抱子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源， 作為選種或分離用的培養(yǎng)基 則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。2, 培養(yǎng)條件(1) 溫度溫度對(duì)多數(shù)品種斜面抱子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37C培養(yǎng)時(shí)，抱子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮

10、回升提前，菌絲過早自溶，效價(jià) 降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制抱子子斜面的培養(yǎng)溫度。(2) 濕度制備斜面抱子培養(yǎng)基的濕度對(duì)抱子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如土霉素生 產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，抱子制備時(shí)發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)抱子斜面長(zhǎng)得較快，在 含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部抱子長(zhǎng)得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā) 呈干疤狀，抱子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面抱子長(zhǎng)得慢，主要由于試管 下部冷凝水多而不利于抱子的形成。從表中看出相對(duì)濕度在40%45%時(shí)抱子數(shù)量最 多，且抱子顏色均勻，質(zhì)量較好。表7-1不同相對(duì)濕度對(duì)龜裂鏈霉菌斜面生長(zhǎng)的影響相對(duì)濕度(%)斜面外觀活抱子計(jì)數(shù)(億/支)16.519

11、上部稀薄、下部稠略黃1.22536上部薄、中部均勻發(fā)白2.34045一片白，抱子豐富，稍皺5.73, 培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間(1) 培養(yǎng)時(shí)間一般來(lái)說(shuō)，衰老的抱子不如年輕的抱子，因?yàn)樗ダ系谋ё右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階 段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的抱子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。解決措施：抱子培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)該控制在抱子量多、抱子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培 養(yǎng)。(2) 冷藏時(shí)間斜面冷藏對(duì)抱子質(zhì)量的影響與抱子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種抱子斜面 培養(yǎng)4天左右即于4C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏78天菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng) 以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時(shí)間對(duì)抱子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面抱子在

12、冷藏兩個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月降低 18%，冷藏3個(gè)月后降低35%。4, 接種量接種量大小影響到培養(yǎng)基中抱子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。二、影響種子質(zhì)量的因素及控制生產(chǎn)過程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：抱子的質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種 齡、接種量。A 拉餐甘I，培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要滿足以下要求：(1) 營(yíng)養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要(2) 選擇有利于抱子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；(3) 營(yíng)養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；(4) 營(yíng)養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高(5) 營(yíng)養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2,培養(yǎng)條件(1) 溫度(2) 通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)

13、基外，有足夠的通氣量可以 提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況 下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差 1倍。但也有例外，例如 土霉素生產(chǎn)菌，一級(jí)種子罐的通氣量小對(duì)發(fā)酵有利。3, 種齡種齡:是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí) 間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量還未達(dá)到最大值時(shí)的培 養(yǎng)時(shí)間較為合適。時(shí)間太長(zhǎng)，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短， 造成發(fā)酵前期生長(zhǎng)緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實(shí)驗(yàn)來(lái) 確定。如嗜堿性芽抱桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時(shí)最好(見下

14、圖)。4, 接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度，采用較大的接種量 可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來(lái)，并可減少雜 菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)。但接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵。過大會(huì)引起溶氧不足，影 響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā) 酵罐的生產(chǎn)率_一卩 丄_ I13670接種欺）圖8刁 接種董對(duì)緘性蛋怙酶產(chǎn)生的影響通常接種量，細(xì)菌15%，酵母菌510%，霉菌715%,有時(shí)2025%二、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來(lái)的生產(chǎn)能力。因此首

15、先必 須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無(wú)雜菌侵入，以獲 得優(yōu)良種子。因此在生產(chǎn)過程中通常進(jìn)行以下兩項(xiàng)檢查。（1）菌種穩(wěn)定性的檢查（2）無(wú)（雜菌）檢查四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1，細(xì)胞或菌體菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等）單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； 霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和 內(nèi)含物情況好。2，生化指標(biāo)種子液的糖、氮、磷的含量和 pH 變化。3，產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物 生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。4，酶活力種子液

16、中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。五、種子異常分析菌種生長(zhǎng)速度，過快或過慢菌絲結(jié)團(tuán)菌絲粘壁第三節(jié) 實(shí)例 一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)斜面菌種一一級(jí)種子培養(yǎng)一二級(jí)種子培養(yǎng)T發(fā)酵罐1，斜面菌種的培養(yǎng) 菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長(zhǎng)而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對(duì)純，不得 混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含 或少含糖為原則。(1) 斜面培養(yǎng)基組成葡萄糖 0.1%，蛋白陳 1.0%，牛肉膏 1.0%，氯化鈉 0.5%，瓊脂 2.02.5%， pH 7.07.2(傳代和保藏斜面不加葡萄糖) 。(2) 培養(yǎng)條件3334°C，培養(yǎng) 1824h。2，一

17、級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分， 多含有機(jī)氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長(zhǎng)菌考慮。(1) 培養(yǎng)基組成葡萄 糖 2.5%，尿素 0.5%， 硫酸鎂 0.04%，磷酸氫二鉀 0.1%， 玉米漿 2.53.5%(按質(zhì)增減 )，硫酸亞鐵、硫酸錳各 2ppm， pH7.0。(2) 培養(yǎng)條件用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200ml，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率96次/min 的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度3334C。(3) 級(jí)種子質(zhì)量要求種齡：12h, pH 值：6.4± 0.1光密度：凈增0D值0.5以上殘?zhí)牵?.5%以下 無(wú)菌檢查：(-)噬菌

18、體檢查：(-)鏡檢：菌體生長(zhǎng)均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽(yáng)性反應(yīng)。3, 二級(jí)種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級(jí)種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到 種子罐的二級(jí)種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。(1) 培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成(%)T6-13B9T738AS1.299水解糖2.52.52.52.5玉米漿2.5-3.52.5-3.52.5-3.52.5磷酸氫二鉀0.150.150.20.1硫酸鎂0.040.040.050.04尿素0.40.40.50.5Fe+ (ppm)2222Mri+ (ppm)2222pH6.8-7.06.8-7.07.06.5-6.8(2) 培養(yǎng)條件接種

19、量：0.81.0% 培養(yǎng)溫度：3234C 培養(yǎng)時(shí)間：78h通風(fēng)量：50L種子罐1:0.5 攪拌轉(zhuǎn)速340r/min ； 250L種子罐1:0.3 攪拌轉(zhuǎn)速300r/ min 500L 種子罐 1:0.25 攪拌轉(zhuǎn)速230r/ min(3) 二級(jí)種子的質(zhì)量要求種齡：78hpH: 7.2左右OD值凈增0.5左右無(wú)菌檢查(-) 噬菌體檢查(-)、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)一般可采用三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)：第1級(jí)到第2級(jí)為8-10倍，第2級(jí)到第 3級(jí)為4-6倍。1, 實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng)斜面限種.一軽 1血麥汁試管50m凌汁三觥培養(yǎng)一歷仏 34天25 匕 2436b2524h300ml麥汁三鮪培養(yǎng)300ta諼汁三角

20、襯養(yǎng)2225t,24h20-22t,24h10L麥汁卡氏JI培養(yǎng)(容量15L)1 卜 2Q 匕 2436h2, 車間擴(kuò)大培養(yǎng)R氏堆1OLI議生雒100 J滅菌童汁70L14-16T-“宜3天20kP玖評(píng)去上清鞭6OL14-16T培養(yǎng)創(chuàng)h20kPa卜6OL滅菌凌汁余2OL10-12T2-3 天601培養(yǎng)液種子保療L兀20k Pa1個(gè)月靂趙罐10001/有效、 滅領(lǐng)麥汁苗00匚I 1214尤，培養(yǎng)劃h 追加滅朗麥汁600LI 10-12.培養(yǎng)S4h 繋殖確45OOIX有效 加麥汁40Q0L l9-HT-ifi24h加麥汁lOm1培養(yǎng)24h十麥汁至20m,R1(TC,盤酵丁 8天第二節(jié)生產(chǎn)發(fā)酵罐的無(wú)

21、菌接種生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個(gè)方面：從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或抱子懸浮液容器中移 種入一個(gè)種子罐；從一個(gè)種子罐移入另一個(gè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中。(1 )從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或抱子懸浮液容器接種通常有兩種方式泡子懸浮 液容器種子2,從種子罐接種蒸汽第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種的保藏1、菌種保藏的意義菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有 關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生 物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時(shí) 還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來(lái)而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。2、菌種保藏的原理菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理

22、生化特點(diǎn)人工創(chuàng)造條件使抱子或菌體的生長(zhǎng)代 謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低水平缺氧 狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于 體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法首先應(yīng)能長(zhǎng)期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還需考慮 到方法本身的簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。3、菌種保藏的方法(1) 斜面低溫保藏法將菌株接種于合適斜面培養(yǎng)基上，待生長(zhǎng)好后置于 4 冰箱保藏，每隔一定時(shí)間 進(jìn)行移接培養(yǎng)后再將新斜面繼續(xù)保藏。這種保藏方法簡(jiǎn)單，存活率高，易于推廣，經(jīng)常使用的菌種可采用這種方法。 其缺點(diǎn)是菌種仍有一定強(qiáng)度的代謝活動(dòng)條件，保存時(shí)間不長(zhǎng)，而且傳代多，因此菌 種客易產(chǎn)生變異。（

23、2）石蠟油封保藏法 將生長(zhǎng)好的新鮮斜面在無(wú)菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上 端1cm使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內(nèi)保藏即可。這種方法也比較簡(jiǎn)便，且保藏時(shí)間一般可長(zhǎng)達(dá) l 年以上。適于保存部分霉菌、 酵母菌、放線菌，但對(duì)細(xì)菌效果較差，對(duì)某些能同化烴類的微生物則不適用。（3）砂土管保藏法 將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過菌的砂土管中，于真空干燥器內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有干燥劑的容器中，密封低溫保藏。本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得 以棲息。適用于細(xì)菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對(duì)干燥敏感的無(wú)芽 孢的細(xì)菌和酵母菌。主要包括砂土制備和真空抽干兩步。（4）冷凍干燥法 此法的

24、原理是在低溫下迅速將細(xì)胞凍結(jié)以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)處于極低水平，不易發(fā)生變異和死亡，因 而能長(zhǎng)期保存，一般為 510 年。微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì) 作保護(hù)劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。該法存活率高，變異率低，并能廣泛 適用于細(xì)菌（有芽孢和無(wú)芽孢的） 、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是 目前廣泛采用的好方法。其缺點(diǎn)是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，要求嚴(yán)格，并需有一定設(shè) 備條件。（5）超低溫保藏法 由于現(xiàn)在超低溫冰箱的使用已較普及，所以菌種的超低溫保藏法在生產(chǎn)企業(yè)和 研究機(jī)構(gòu)已得到廣泛應(yīng)用。該方法的要點(diǎn)是：將要保藏的菌種置于 1

25、0%甘油或二甲 基亞砜保護(hù)劑中，密封于試管或安瓿管中，然后將其放入超低溫冰箱中于-70 c下保 藏。該法簡(jiǎn)便易行，而且保藏效果較好。二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯 微生物具有生命活動(dòng)能力，其世代時(shí)間一般是很短的，在傳代過程中易發(fā)生變 異甚至死亡， 因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化， 并有可能使優(yōu)良菌種丟失， 所以， 如何保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題。(一)微生物菌種的衰退 菌種退化通常是指在較長(zhǎng)時(shí)期傳代保藏后，菌株的一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài) 特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。常見的菌種衰退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌 落顏色的改變。在生理上常指菌種發(fā)酵能力的降低，有些菌的抗噬菌

26、體能力下降。 對(duì)誘變育種而獲得的高產(chǎn)變異株則常表現(xiàn)出恢復(fù)野生型性狀等。但菌種的真正退化 必須與由于環(huán)境原因變化而引起菌種形態(tài)、和生理上的變異區(qū)別開來(lái)。如培養(yǎng)基中 微量元素缺乏會(huì)導(dǎo)致孢子數(shù)量減少，也會(huì)引起孢子顏色的改變。此外，溫度、pH、不同碳氮源都會(huì)導(dǎo)致菌種變化。但只要一旦恢復(fù)正常條件，這些現(xiàn)象就會(huì)消失。此 外，雜菌污染也會(huì)造成菌種退化的假象。因此，必須正確判斷是否退化，才能找出 正確的解決辦法。一般菌種退化是從量變到質(zhì)變逐漸發(fā)生的，同時(shí)也是整個(gè)群體中 產(chǎn)量降低及其相聯(lián)系的種種特性的變化，而不是指單個(gè)細(xì)胞的改變。引起菌種退化的原因主要有：1、基因突變 菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果

27、控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變則 會(huì)引起產(chǎn)量下降， 如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變則孢子性能就會(huì)下降。 當(dāng)然， 這些負(fù)突變都是自發(fā)形成的。經(jīng)常處于旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞比休眼狀態(tài)細(xì)胞發(fā)生突 變的機(jī)率大得多。在發(fā)酵生產(chǎn)中常用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，如缺陷型發(fā)生回復(fù)突變就 會(huì)使產(chǎn)量水平下降。如粘質(zhì)賽氏桿菌 ( Serratia marcescens )H-2892 菌株生產(chǎn)力為 18g/L 組氨酸，經(jīng) 5 次傳代后因回復(fù)突變型增多，產(chǎn)量下降至 4g/L 。很多抗生素生 物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都部分或全部受質(zhì)?；蚩刂?。當(dāng)菌株連續(xù)傳 代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，則生產(chǎn)能力也顯著下降。2、變

28、異菌株性狀分離 變異菌株性狀分離也會(huì)引起高產(chǎn)型狀的喪失。在菌種篩選工作中經(jīng)常遇到初篩 搖瓶產(chǎn)量很高，復(fù)篩產(chǎn)量逐漸下降而被淘汰的現(xiàn)象，在霉菌中更為常見。這是一種 廣義的退化現(xiàn)象。當(dāng)誘變的單菌落是由一個(gè)以上孢子或細(xì)胞形成，而其中只有一個(gè) 孢子或細(xì)胞是高產(chǎn)時(shí)，在移接傳代過程中，這個(gè)高產(chǎn)菌株數(shù)量減少，當(dāng)然產(chǎn)量也就 下降。即使菌落是由一個(gè)孢子或單個(gè)細(xì)胞形成，只要它是多核細(xì)胞，在誘發(fā)突變中 核的變化不會(huì)都一樣，隨著菌種傳代和核的分離也會(huì)使性狀表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會(huì) 隨之變化，即使是單核抱子發(fā)生突變時(shí)，如果雙鏈 DNA上僅一條鏈上某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生 變化，經(jīng)移殖后也會(huì)出現(xiàn)性狀分離。因此一個(gè)較穩(wěn)定的變異株的獲得必須經(jīng)

29、過多次 分離純化。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細(xì)胞DNA雙鏈中一條鏈的某一點(diǎn)發(fā)生突變，另一條鏈完全失活不再?gòu)?fù)制來(lái)提高純菌產(chǎn)生率。通過實(shí)驗(yàn) 得到下表所示數(shù)據(jù)。不同劑量紫外線處理裂殖酵母時(shí)不純菌落百分?jǐn)?shù)劑量（以存活率計(jì)，%）菌落總數(shù)突變菌落數(shù)突變頻率（突變菌落/103）不純困洛（%）純不純100 （對(duì)照）1216510.0880100120601312243608085534620273020604922651716.72112098841952822.613誘變突變株的穩(wěn)定性和誘變劑作用機(jī)制有關(guān)，一般認(rèn)為誘發(fā)DNA堿基轉(zhuǎn)換或顛換時(shí)不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較多，而誘發(fā)缺失交界時(shí)不穩(wěn)定菌株出

30、現(xiàn)較少，因?yàn)槿笔遣?能回復(fù)的。3、連續(xù)傳代連續(xù)傳代也是菌種退化的直接原因。個(gè)別細(xì)胞性狀改變不足以引起菌種退化， 經(jīng)多次傳代，退化細(xì)胞在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為 一株退化菌株。以芽抱桿菌的黃嘌呤缺陷型在斜面上移殖代數(shù)對(duì)回復(fù)突變率和產(chǎn)量 的關(guān)系為例，如下表所示。產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系實(shí) 驗(yàn)移接代數(shù)每代斜面保存時(shí)間（天）回復(fù)子比數(shù)腺甘產(chǎn)量（g/L）101471/4.5x 10613.522133， 141/2.4x 10614.93647， 3， 9， 3， 71， 141/2.2x 10510.74747， 3， 9， 3， 13， 58， 141/3.5x 10513.15947， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 47， 41/5.3x 1038.161247，3, 9, 3，13，8, 3，4，14, 6，6, 311/1.0x 1037.4由上表可見，雖菌種總的保存時(shí)間都是 147天，但隨著移植代數(shù)的增加，