細(xì)胞污染及處理方法

1、細(xì)胞污染及處理方法總結(jié)潔凈區(qū)，并不是沒有細(xì)菌，而是細(xì)菌的數(shù)量非常少， 國家標(biāo)準(zhǔn)100級的潔凈標(biāo)準(zhǔn)是浮游 菌數(shù)不得超過5個每立方米，沉降菌數(shù)不得超過 1個每培養(yǎng)皿.而國外的標(biāo)準(zhǔn)比我國的還要 高一點，要求的數(shù)量更少。所以在我們的潔凈操作臺里，并不是真正一個細(xì)菌都沒有的，所以在操作的時候還是要 盡量利索迅速地完成操作。盡量減少進入培養(yǎng)體系細(xì)菌的數(shù)量。所以處理細(xì)菌污染的重要原則就是：無限地稀釋細(xì)菌的濃度，無限地減少細(xì)菌的數(shù)量!、細(xì)菌污染培養(yǎng)基：顏色發(fā)紅，液體清亮或渾濁;顯微鏡下：有黑點或桿狀物在到處游走，細(xì)胞部分脫落，出現(xiàn)細(xì)胞碎片;成像:昉-圖一：桿菌污染T-J. I 嚴(yán).'J.-.Jf J.

2、圖二：白色鏈球菌以下是摘自丁香園的處理方法:1).將污染的培養(yǎng)液倒掉，轉(zhuǎn)燒瓶口，加入 10mlPBS適當(dāng)晃動清洗培養(yǎng)瓶，然 后倒掉。轉(zhuǎn)燒瓶口。2)3).繼續(xù)加入10mlPBS同樣方法晃動，清洗培養(yǎng)瓶，然后倒掉。.繼續(xù)加入5mlPBS同樣方法洗瓶，主要是培養(yǎng)面，然后倒掉。4).重復(fù)步驟3再洗。5).重復(fù)步驟3再洗。6)7).加入3-5ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。.加入3ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。8).再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。2ml雙抗。9).加入10ml培養(yǎng)液，加入2ml雙抗，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5小時之后，倒掉培 養(yǎng)基，加入PBS洗瓶兩次，然后加入胰酶消化，

3、吹打后置于離心機800-1000r/min 離心，然后洗一次。置于新的培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)，培養(yǎng)體系加入10) .24h之后，視情況換液，若仍然污染嚴(yán)重，培養(yǎng)基渾濁，重復(fù)以上步驟， 若看不到污染物，則繼續(xù)步驟1)、3)、4)、6)、8)，然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)體系加入2ml雙抗.11） .24h之后，若仍污染嚴(yán)重，可再重復(fù)一次，若還污染只能棄之（不過一般 沒有出現(xiàn)這種情況），若鏡下不見污染物，則換液PBS洗瓶，正常培養(yǎng)。（常見為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）若細(xì)胞狀態(tài)極差，盡早處理掉細(xì)胞，并找出污染源，對培養(yǎng)箱，生物安全柜，細(xì) 胞房進行消毒處理。二、真菌污染培養(yǎng)基：有的培養(yǎng)液清亮，不變色;顯微鏡下：有絲

4、狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì) 菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。成像:/ -X"7更圖三：看上去像白色念珠菌污染r-處理方法：若為霉菌或者真菌污染,（在30卩g/ml時會有細(xì)胞毒性）加入兩性霉素。另外也可以選擇在培養(yǎng)基里加B清洗和培養(yǎng)，終濃度一般為2.5卩g/ml3ug/ml的制霉菌素或放線菌素D。其它操作同細(xì)菌。二、霉菌污染培養(yǎng)基：培養(yǎng)液是清亮的;顯微鏡下：絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長,但

5、時間長之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差； 成像:處理方法：預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；（原來我們這里也有霉菌感染的，不過后面在培養(yǎng)基里加上了0.5 %的大?？担ㄔ瓉淼碾p抗各改為0.25 %的青霉素和鏈霉素）摘自丁香園），效果還可以！你可以試試！ ！但 細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補，建議舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境徹底消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材， 如果只是個別污染，可能是操作問題，就要注意操作 霉菌污染多來自空氣，所以做實驗時說話聊天，或瓶口敞開時間太長，還有培養(yǎng)箱開關(guān)頻繁是 主要原因，還是

6、多找自身原因.四、支原體污染支原體污染后，不會立即使細(xì)胞死亡，可以與細(xì)胞長期共存， 培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁， 細(xì)胞 無明顯變化，外觀上給人以正常感覺， 實則細(xì)胞收到多方面潛在影響， 如引起細(xì)胞變形， 影 響DNA合成，抑制細(xì)胞生長等。培養(yǎng)基：可能無明顯表現(xiàn);顯微鏡下：慢慢會使細(xì)胞狀態(tài)變差，生長變慢，在顯微鏡下觀察可能會有小黑點，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生 渾濁。細(xì)胞傳代以后就出現(xiàn)細(xì)胞間黑點，細(xì)胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的 細(xì)胞，最終細(xì)胞漂浮，完全死亡。細(xì)胞生長緩慢，或者出現(xiàn)無明顯誘因脫落，凋亡，細(xì)胞碎 片增多，有的甚至只表現(xiàn)為細(xì)胞狀態(tài)日漸不佳。成像: 處理方法：采用支原體清除劑，有同學(xué)說用泰樂處理支原

7、體污染效果比較好。用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時用 50ug/mlTylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話，建議用8ug/ml的濃度。般處理起來比較復(fù)雜，因此多放棄細(xì)胞重新培養(yǎng)。五、黑膠蟲污染培養(yǎng)基：可能無明顯表現(xiàn)，或液體顏色異樣 顯微鏡下：大量黑點原地震動，與細(xì)菌污染相鑒別，細(xì)胞狀態(tài)不佳。有的因細(xì)胞密度較高, 或細(xì)胞增殖較快，細(xì)胞代謝產(chǎn)物增多，要注意鑒別。成像: 處理方法：黑膠蟲在科研領(lǐng)域還是很未知的啊。所以沒有什么好的應(yīng)對方法。預(yù)防為主！ 還是要強調(diào)無菌操作??！尤其注意血清的質(zhì)量！這個是主要

8、來源。一般建議用北美血清, 這個黑膠蟲污染會概率小。六、原蟲污染培養(yǎng)基：培養(yǎng)液可輕微渾濁顯微鏡下：細(xì)小的點狀物數(shù)量非常多， 輕微活動，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢， 而且細(xì)胞狀態(tài)不好， 邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這 種共生是非常普遍的， 但他們的數(shù)量小，細(xì)胞占優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達一定的數(shù)量時就會影響到細(xì)胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。成像: 處理方法:在操作的過程中，一定要小心操作動作，輕柔緩慢，切忌大動作魯莽。防止細(xì)胞脫落。這個拯救細(xì)胞還是主要針對無路可退的時候。污染還是重在預(yù)防！ ！細(xì)胞房 培養(yǎng)箱每兩周更換一次水（高壓過的雙蒸水），條件允許的每兩周可以用酒精擦洗一遍培養(yǎng)箱;地面每兩到三天用新潔爾滅拖