實(shí)驗(yàn)一、植物基因工程簡(jiǎn)介ppt課件

1、王歡歡hhwanggucas.a零一二.九;植物基因工程概述20192019全球商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物分布圖全球商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物分布圖植物基因工程是在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，改良植物性狀、植物基因工程是在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，改良植物性狀、培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)作物新品種的分子育種技術(shù)。培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)作物新品種的分子育種技術(shù)。;植物基因表達(dá)載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建植物基因表達(dá)載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建堿裂解法小量制備質(zhì)粒堿裂解法小量制備質(zhì)粒農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草及擬南芥農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草及擬南芥GUSGUS染色檢測(cè)基因瞬時(shí)表達(dá)染色檢測(cè)基因瞬時(shí)表達(dá)植

2、物組織植物組織D DNANA的提取的提取植物組織植物組織R RNANA的提取的提取DNADNA的的PCRPCR檢測(cè)，反轉(zhuǎn)產(chǎn)物檢測(cè)，反轉(zhuǎn)產(chǎn)物RT-PCRRT-PCR一一二二三三四四五五六六七七八八;用于攜帶用于攜帶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制或保存的載體稱為克隆載體。片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制或保存的載體稱為克隆載體?？寺】寺≥d體載體復(fù)制復(fù)制基因基因選擇性選擇性標(biāo)記標(biāo)記多克隆多克隆位點(diǎn)位點(diǎn) TA克隆載體克隆載體;表達(dá)載體是可攜帶外源表達(dá)載體是可攜帶外源DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制并轉(zhuǎn)錄、翻片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制并轉(zhuǎn)錄、翻譯的載體。一般在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了基因表達(dá)的調(diào)控元件。譯的載體。一般

3、在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了基因表達(dá)的調(diào)控元件。 原核啟動(dòng)子原核啟動(dòng)子 終止子終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS原核表達(dá)原核表達(dá)載體載體 真核啟動(dòng)子真核啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄終止序列轉(zhuǎn)錄終止序列 不同的復(fù)制子不同的復(fù)制子真核表達(dá)真核表達(dá)載體載體u 很多真核基因在原核中表達(dá)時(shí)難以獲得有活性的蛋白質(zhì)很多真核基因在原核中表達(dá)時(shí)難以獲得有活性的蛋白質(zhì)-真核真核表達(dá)載體表達(dá)載體酵母表達(dá)載體酵母表達(dá)載體噬菌體載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體穿梭載體穿梭載體pET載體系列載體系列;實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 植物基因表達(dá)載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建植物基因表達(dá)載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建植物表達(dá)載體基礎(chǔ)元件植物表達(dá)載體基礎(chǔ)元件啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止

4、子目的基因目的基因標(biāo)記基因標(biāo)記基因;植物表達(dá)載體：植物表達(dá)載體：pGreen 系列：系列：pGreen0029，pSouppCAMBIA系列：系列： 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 2300, 2301,pCAMBIA super1300, pCAMBIA super1300-GFP,pPZP212, pPZP2121, pPZP212-GFPpBI121，pBI121-GFP, pBI101，221pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-RFP , pRTL2-YFP等等等等干擾載體：干擾載體：pART27農(nóng)桿菌菌株：農(nóng)桿菌菌株：LBA4404,

5、EHA103,105,GV3101;設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物PCRPCR擴(kuò)增目擴(kuò)增目的基因的基因DNADNA測(cè)序驗(yàn)測(cè)序驗(yàn)證證酶切酶切連接表達(dá)連接表達(dá)載體載體轉(zhuǎn)化植物轉(zhuǎn)化植物抗生素篩抗生素篩選選轉(zhuǎn)基因植轉(zhuǎn)基因植物物;根據(jù)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)引物，酶切位點(diǎn)外加保護(hù)堿基根據(jù)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)引物，酶切位點(diǎn)外加保護(hù)堿基引物長(zhǎng)度大于引物長(zhǎng)度大于16bp,一般為一般為20-24個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸 引物與靶序列間的引物與靶序列間的Tm值不應(yīng)過(guò)低值不應(yīng)過(guò)低 引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。即不能有引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。即不能有4bp以上的回文序列以上的回文序列 兩引物間不應(yīng)有大于兩引物間不應(yīng)有大于4pb以上的互補(bǔ)序列或

6、同源序列，在以上的互補(bǔ)序列或同源序列，在3端不應(yīng)有任何端不應(yīng)有任何互補(bǔ)堿基互補(bǔ)堿基 引物中堿基的分布盡可能均勻，引物中堿基的分布盡可能均勻，G+C含量接近含量接近50%Primer L：ACGCCATGGCGCAATCTGTTCCTTAT Nco IPrimer R: CGGTCGACTTATTGTGCAGCTGCTTG Sal IMinimum free energy of the structure= -1.35 kcal/molA GTTGATAAAGCGGTTTCCAGCGGMinimum free energy of the structure= 0.00 kcal/molC GCA

7、ATCTGTTCCTTATGG;核酸內(nèi)切限制酶，能夠識(shí)別雙鏈核酸內(nèi)切限制酶，能夠識(shí)別雙鏈DNADNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割切割DNADNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。不同酶的識(shí)別位點(diǎn)不同雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。不同酶的識(shí)別位點(diǎn)不同酶切位點(diǎn)：酶切位點(diǎn)：DNADNA上一段堿基的特定序列，限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別出這個(gè)序列上一段堿基的特定序列，限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別出這個(gè)序列并在此將并在此將DNADNA序列切成兩段。序列切成兩段。限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀DNADNA連接酶連接酶 分子縫合針?lè)肿涌p合針基因的載體基因的載體 分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車基

8、因工程基因工程=DNA=DNA重組重組BamHIBamHI同尾酶同尾酶: :產(chǎn)生相同的粘性末端產(chǎn)生相同的粘性末端常用限制性內(nèi)切酶：常用限制性內(nèi)切酶：TakaraTakara，NEBNEB等等HindIIIHindIIIBglIIBglII;u 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的的DNA片段，片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。u 對(duì)于較大片段的對(duì)于較大片段的DNA，則要用低濃度的瓊脂糖凝膠。，則要用低濃度的瓊脂糖凝膠。u DNA分子在高

9、于等電點(diǎn)的分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。u 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同相對(duì)分子質(zhì)量的子本身的大小和構(gòu)型。具有不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣：片段泳動(dòng)速度不一樣：分子越小，遷移越快；分子越大，遷移越慢，遷移速率與相對(duì)分子質(zhì)量的分子越小，遷移越快；分子越大，遷移越慢，遷移速率與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。Marker 2000;Enzyme1：1 LEnzyme2：1 LBuf

10、fer：2 LTemplate：X LddH2O: 補(bǔ)齊至補(bǔ)齊至20 L37水浴水浴2 h活性單位活性單位U U：在：在50 l50 l反應(yīng)液中，反應(yīng)液中，3030溫度下反應(yīng)溫度下反應(yīng)1 1小時(shí)，將小時(shí)，將1 g1 g的的DNADNA完全分解的酶量定義為完全分解的酶量定義為1 1個(gè)活性單位個(gè)活性單位(U)(U)單酶切單酶切雙酶切雙酶切;1. DNA的純度，蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、的純度，蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS、鹽離子、鹽離子等都會(huì)影響活性等都會(huì)影響活性2. DNA的甲基化程度，核酸內(nèi)切限制酶不能夠切割甲基化的核苷酸的甲基化程度，核酸內(nèi)切限制酶不能夠切割甲基化的核苷酸序列序列3. 酶切反應(yīng)溫度，不同內(nèi)切酶具有不同的最適反應(yīng)溫度，酶切反應(yīng)溫度，不同內(nèi)切酶具有不同的最適反應(yīng)溫度，4. DNA的分子結(jié)構(gòu)，超螺旋和線性的分子結(jié)構(gòu)，超螺旋和線性5. 緩沖液的影響，緩沖液的影響，Mg2+的濃度，甘油濃度的濃度，甘油濃度本卷須知：本卷須知：1.盡量使用同品牌的酶盡量使用同品牌