pet表達系統(tǒng)文檔良心出品

1、對于全世界許多研究者,Novagen的pET系統(tǒng)已成為在大腸桿菌中蛋白表達的首選.該系統(tǒng)成功的一個主要原因是目標基因被克隆到不為大腸桿菌RNA聚合酶識別的 T7啟動子之下,因此在參加T7 RNA聚合酶之前幾乎沒有表達發(fā)生.克隆到 pET載體的基因實際上是被關閉的,不會由于產(chǎn)生的蛋白對細胞有毒性而引起質粒不穩(wěn)定.重組質粒轉移到染色體上含有一拷貝由lacUV5限制的 T7 RNA聚合酶基因的表達宿主中,并通過參加IPTG誘導表達；也可通過 l CE6感染原始克隆宿主菌來提供T7 RNA 聚合酶.使用大腸桿菌啟動子系統(tǒng) (如tac、lac、 trc、 pL)有困難的許多基因已經(jīng)在pET系統(tǒng)中穩(wěn)定克隆

2、和表達.T7 RNA聚合酶的選擇性和活性使得幾乎所有細胞資源都用于為目標基因表 達.誘導后幾小時目標產(chǎn)物就可超過細胞總蛋白的50%.新開發(fā)的T7驅動表達技術以 pETBlue TM系統(tǒng)為代表.pETBlue載體包括了 pET 用于表達的優(yōu)點,在目標基因克隆和質粒DNA操作的方面更為方便.pETBlue TM 系統(tǒng)：新一代 T7表達載體pETBlue載體代表了新型表達載體,它具備所有廣受歡送的克隆載體的最理想特點和T7驅動蛋白表達的完全功能.目標基因以相對于修飾的大腸桿菌tet啟動子的反義方向插到lacZ a -肽編碼區(qū),因此可進行藍/白斑篩選.正確定位于目標基因正義方向上游的T7轉錄和譯信號使

3、表達成為可能.與標準pET載體一樣,通過轉化入DE3溶原菌并用IPTG誘導或通過l CE6感染原始宿主菌生產(chǎn)目標蛋白.優(yōu)點 藍/白斑篩選,便于克隆 高拷貝數(shù),質粒 DNA高產(chǎn) 以AccepTor TM載體或perfectly Blunt a載體形式提供,便于快速PCR克隆 目標基因無根底水平表達,消除了毒性基因產(chǎn)物相關的質粒不穩(wěn)定性 表達水平與經(jīng)典 pET載體相同 用Tuner TM (DE3)pLacI宿主菌實現(xiàn)真正的表達水平“變阻器限制.PET系統(tǒng)：大腸桿菌中蛋白表達的金字招牌pET載體中,目標基因克隆到 T7噬菌體強轉錄和譯信號限制之下,并通過在宿主細胞提供T7 RNA聚合酶來誘導表達.

4、Novagen的pET系統(tǒng)不斷擴大,提供了用于表達的新技術和選擇,目前共包括36種載體類型、15種不同宿主菌和設計用于有效檢測和純 化目標蛋白的許多其它相關產(chǎn)品.優(yōu)點 是原核蛋白表達引用最多的系統(tǒng),在任何大腸桿菌表達系統(tǒng)中,根底表達水平最低 真正的調節(jié)表達水平的“變阻器限制 提供各種不同融合標簽和表達系統(tǒng)配置 可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌 許多載體以LIC載體試劑盒提供,用于迅速定向克隆PCR產(chǎn)物 許多宿主菌株以感受態(tài)細胞形式提供,可立即用于轉化陽性pFORCE TM克隆系統(tǒng)具有高效克隆PCR產(chǎn)物、陽性選擇重組體和高水平表達目標蛋白等特點.pETBlue T

5、M 系統(tǒng)T7驅動的嚴緊限制表達、藍 /白斑篩選、質粒產(chǎn)量高新奇的pETBlue TM系統(tǒng)兼有廣受歡送的藍 /白斑篩選載體所具有的通過目測確定 重組體和高質粒拷貝數(shù),以及pET載體嚴緊限制的高蛋白表達等特點.藍/白斑篩選通過使用弱組成型大腸桿菌啟動子tet 驅動lacZ a -肽表達而實現(xiàn),而目標基因表達由相反方向的T7啟動子驅動.目標序列插入多克隆位點 MCS 破壞了 lacZ a -肽的表達, 在NovaBlue菌株中當存在 x-gal時產(chǎn)生白菌落表型,而帶有非重組載體的菌落變藍.由 于T7驅動的蛋白表達要求插入片段克隆到相對于tet啟動子的反義方向,因此實際上沒有目標序列的根底表達.相對于

6、 pET載體,pETBlue質粒上高拷貝PUC復制起點增加了質粒產(chǎn)量,為測序、突變和其它質粒操作帶來方便.如果插入序列相對于 T7 lac啟動子為正義方向且符合每個載體的譯要求,pETBlue載體中目標基因可以高水平表達.用兩種方法進行蛋白表達：用 l CE6 l pL啟動子限制T7 RNA聚合酶表達的噬菌體感染,或轉化重組pETBlue質粒到宿主菌Tuner TMDE3pLacI或 Origami TM DE3pLacI 中并用IPTG 誘導.這些宿主菌染色體上帶有一拷 貝lacUV5限制的T7 RNA聚合酶基因,并通過相容的pLacI質粒提供足夠lac阻遏蛋白,以保證低水平的未誘導表達.T

7、uner菌株的lacY狀態(tài)使整個培養(yǎng)細胞被均一的誘導,并隨IPTG劑量誘導有不同的蛋白表達水平. Origami菌株能夠增強胞質中二硫鍵形成.pETBlue-1pETBlue-1便于從5'端編碼開放讀碼框架的插入片段表達未融合的天然蛋白.該載 體EcoR V GATATC克隆位點位于強 T7基因10核糖體結合位點RBS 附近.含有 ATG起始密碼子或 5'端具有一個位置適宜的G核甘酸插入片段成為一個適宜的大腸桿菌譯起始位點.pETBlue-2pETBlue-2提供了載體編碼的ATG起始密碼子和多種下游克隆位點.MCS 5'和3'端兩套各三個重疊平末端酶切位點便于

8、將任何插入片段克隆到讀碼框中.在載體確定的讀碼框中,這些酶產(chǎn)生的平末端終止于密碼三聯(lián)體的不同位置.因此只要插入方向正確,任何插入片段可克隆到經(jīng)過適宜平末端酶切割的載體的讀碼框中.而且,任何不含內(nèi)部終止密碼子的插入片段都可與 C-末端HSV.Tag a表位和His.Tag a序列克隆到同一讀碼框中.pETBlue TM PCR克隆試齊盒方便地將 PCR擴增DNA直接克隆到 pETBlue載體中除了含有未切割質粒的 pETBlue TM系統(tǒng), Novagen還提供可立即插入 PCR產(chǎn)物的 pETBlue載體.已有兩種試劑盒： AccepTor TM載體試劑盒能夠插入帶單個 3' -dA突出

9、 的DNA,如非校對 DNA 聚合酶如Taq DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物；而perfectly Blunt a克隆試劑盒設計用于克隆任何末端形式的插入片段.在pETBlue-1 AccepTor載體中表達插入基因的引物設計：pETBlue-1 :用5'端ATG開始的正義引物進行擴增,能夠保證在大腸桿菌中有效合成蛋 白的RBS和譯起始位點之間的最適距離.目標序列竣基端引物設計沒有限制.Met-正義弓 I 物 5' -ATG XXX -反義引物無限制 pET系統(tǒng)概述pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大系統(tǒng).根據(jù)最初由Studier等開發(fā)的T7啟動子驅動系統(tǒng),Novagen

10、的pET系統(tǒng)已用于表達成千上萬種不同蛋白.限制根底表達水平pET系統(tǒng)提供6種載體-宿主菌組合,能夠調節(jié)根底表達水平以優(yōu)化目標基因的表達.沒有單一策略或條件適用于所有目標蛋白,所以進行優(yōu)化選擇是必要的.宿主菌株質粒在非表達宿主菌中構建完成后,通常轉化到一個帶有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌入DE3溶原菌中表達目標蛋白.在 入DE3溶原菌中,T7 RNA聚合酶基因由lacUV5啟動子限制.未誘導時便有一定程度轉錄,因此適合于表達其產(chǎn)物對宿主細胞生長 無毒害作用的一些基因.而宿主菌帶有pLysS和pLyE時調控會更嚴緊. pLys質粒編碼T7溶菌酶,它是T7 RNA聚合酶的天然抑制物,因此可降低其在

11、未誘導細胞中轉錄目標基 因的水平.pLysS宿主菌產(chǎn)生低量T7溶菌酶,而 pLysE宿主菌產(chǎn)生更多酶,因此是最嚴緊限制的 入DE3溶原菌.有11種不同DE3溶原化宿主菌.使用最廣泛的為 BL21及其衍生菌株,它的優(yōu)點在于缺 失lon和ompT蛋白酶.B834菌株為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型,因此可用35 S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標蛋白進行高特異活性標記.BLR為recA -衍生菌株,改善了質粒單體產(chǎn)量,有助于穩(wěn)定含有重復序列的目標質粒.兩個硫氧還蛋白復原酶trxB 突變菌株AD494,BL21 trxB ,有利于大腸桿菌胞漿中二硫鍵形成.Origami TM 和OrigamiB 菌株為trxB/

12、gor雙突變,這兩個酶是主要復原途徑的關鍵酶.Origami和OrigamiB宿主菌的主要優(yōu)點是能形成正確折迭的含有二硫鍵的蛋白.新的Rosetta TM菌株補充了四種大腸桿菌稀有密碼子的 tRNA ,改善了由于密碼子使用頻率不同而引起的一些真核蛋白低表達.其它菌株背景包括K-12菌株HMS174和NovaBlue ,象BLR 一樣為recA -.這些菌株可穩(wěn)定表達其產(chǎn)物可能導致DE3噬菌體喪失的某些目標基因.由于存在 F附加體編碼的高親和力lacIq阻遏蛋白,NovaBlue為一個有用的嚴緊型宿主菌.此外, Novagen提 供了入DE3溶原化試劑盒,用于制備其它遺傳背景的新表達宿主菌.表達

13、高毒性基因或 制備新的 入DE3溶原菌的另一替代方法是通過l CE6感染提供T7 RNA聚合酶.雖然不如用IPTG誘導 入DE3溶原菌方便,這種策略也被優(yōu)先用于一些應用中.高嚴緊性T7 lac啟動子除了在宿主菌水平選擇三種根本的表達嚴緊性,pET系統(tǒng)中T7啟動子本身提供了兩種不同的嚴緊性選擇：普通 T7啟動子和 T7 lac啟動子.T7 lac啟動子在啟動子區(qū)下游17bp處含有一個 25bp的lac操縱序列.該位點結合lac阻遏蛋白能夠有效降低T7 RNA聚合酶的轉錄,這樣提供了在入DE3溶原菌中抑制根底表達的第二種基于lacI的機制除了抑制lacUV5 .含T7 lac啟動子的pET質粒還具

14、有它們自己的 lacI ,保證足夠的阻遏 蛋白結合到操縱基因位點上.在實際應用中,為了獲得最高產(chǎn)量的蛋白,通常應該測試多種不同的載體/宿主菌組合.限制誘導的表達水平在許多情況下,表達活性可溶性最好的蛋白依賴于宿主細胞的背景、培養(yǎng)條件和適宜的載體配置.通常,目標蛋白活性最高的條件與產(chǎn)量最高的條件不一致.除了根據(jù)載體/宿主菌組合限制T7 RNA聚合酶的根底表達提供不同嚴緊性,pET系統(tǒng)還根據(jù)誘導物 IPTG 濃度,對目標蛋白表達提供了真正的“變阻器限制. Tuner和OrigamiB宿主菌的lacY 突變使這種限制成為可能.選才i pET載體所有的pET載體均來自pBR322,但彼此間先導序列、

15、表達信號、融合標簽、相關限制性 位點和其它特點有所不同.有兩大類pET質粒,即轉錄載體和譯載體：轉錄載體包括 pET-21、pET-23和pET-24 表達目標 RNA,但不提供譯信號.它 們用于從自身帶有細菌譯信號的目標基因表達蛋白.注意：轉錄載體通過命名后面的一個缺失字母后綴加以區(qū)分譯載體含有設計用于蛋白表達的有效譯起始信號.許多載體在讀碼框a、 b和c中帶有克隆位點,分別對應于BamH I位點的GGA、 GAT和ATC三聯(lián)體.選擇要點選擇用于表達的 pET載體通常涉及多種因素.考慮以下三個主要因素： 所表達蛋白的用途 所表達蛋白的信息 克隆策略pET載體表達的蛋白用途各種各樣.例如,表達

16、量為分析級的蛋白可用于活性研究、突變體篩選和定性、篩選配體相互作用和抗原制備.大量活性蛋白用于結構研究、試劑或親和基 質制備.許多載體適合表達用于篩選或抗原制備的分析量蛋白,然而只有載體、宿主菌和培養(yǎng)條件組合十分適宜才可能用于大量純化.如果需要活性蛋白連續(xù)高產(chǎn),應該試驗多種載體、宿主菌和培養(yǎng)條件組合以找到最優(yōu)化結果.任何關于目標蛋白的信息都有助于載體選擇.例如,一些蛋白的活性要求一個或兩個末端沒有外源序列.許多pET載體能夠克隆非融合序列,然而如果特定譯起始序列不能在大腸桿菌中有效利用,表達水平可能受影響.在這些情況下,?？捎糜行П磉_的氨基末端序 列構建融合蛋白,然后在純化后用位點特異性蛋白酶

17、消化去除融合序列.LIC 連接非依賴的克隆策略對這種方法特別有用,由于克隆操作通過腸激酶和因子Xa能夠去除所有氨基端載體編碼序列.由于限制性位點和讀碼框相容性的需要,克隆策略也會影響載體選擇.由于許多pET載體具有共同的限制性位點配置,通?？赡軐⒁淮沃苽涞哪繕嘶蚩寺〉綆讉€載體中.采PCR克隆策略時那么有不同的考慮.LIC載體試劑盒推薦用于此目的,可通過 PCR制備插入片段,而不需要限制性消化載體或插入片段.溶解性和細胞定位考慮了目標蛋白的應用和克隆策略,還應該確定目標蛋白的細胞定位和溶解性,這一點十分重要.在許多實際應用中常希望表達可溶的活性蛋白.特定目標蛋白的溶解性取決于多種因素,包括各自

18、的蛋白序列. 在許多情況下,溶解性不是有或無的現(xiàn)象,載體、宿主菌和培養(yǎng)條件可被用來增加或減少獲得的可溶或不可溶形式的比 例.PET-32載體系列使目標序列與通常能夠增加可溶性蛋白比例的硫氧還蛋白Trx.Tag 融合.新推出的pET-43.1系列具有通過大量系統(tǒng)篩選而得到的一種過量表達時具有極高溶 解性的大腸桿菌蛋白-Nus.Tag融合伴侶,從而進一步提升了目標蛋白的可溶性.此外,trxB 突變株 AD494 和 BL21 trxB ,或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞 漿中形成許多真核蛋白正確折迭和活性所要求的二硫鍵.低溫誘導15 -25. C 也可

19、增加可溶性目標蛋白的比例.獲得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周質中,為折迭和二硫鍵形成有更適宜的環(huán)境.為了到達這一目的,通常使用帶信號肽的載體.一些純化策略可以優(yōu)化胞質中不溶性包涵體的產(chǎn)量.抽提包涵體并溶解,然后目標蛋白在體外重新折迭如使用Novagen的蛋白折迭試劑盒.該過程通常產(chǎn)生高產(chǎn)量初始蛋白并預防宿主細胞中的蛋白降解.然而,重新折迭成活性蛋白的效率隨不同蛋白變化很大,可能相當?shù)?pET-31b + 載體專為產(chǎn)生不可溶融合蛋白而設計,提供了生產(chǎn)小蛋白和多肽的有效方法.滿足不同需要的融合標簽如果融合序列不影響應用, 生產(chǎn)帶有 S.Tag、T7.Tag a、His.Tag a和H

20、SV.Tag a的融合 蛋白會很方便后續(xù)操作,并易于通過蛋白雜交檢測.這些多肽融合序列很小,它們的檢測試劑極特異和靈敏.通過使用相應樹脂和緩沖液試劑盒,GST.Tag、S.Tag和T7.Tag序列可用于親和純化.使用S.Tag和GST.Tag分析試劑盒可對粗提或純化的融合蛋白準確定量.采用一種新奇底物的FRETWorks S.Tag分析試劑盒可通過熒光檢測到少于1fmol的融合蛋白.His.Tag a序列作為純化蛋白的融合伴侶非常有用,尤其對那些以包涵體形式表達的蛋白來 說,它可以使親和純化可在溶解蛋白的完全變性條件下進行.CBD.Tag a在低費用親和純化中非常有用.它們也特另U適用于重新折

21、迭特別是帶有CBDclos .Tag a序列的pET-34b + 和35b + .由于只有正確重新折迭的CBDs結合到纖維素基質上,CBIND親和純化步驟能夠從制備物中去除不正確折迭的分子.任何標簽可用于固定目標蛋白,但由于CBD.Tag序列的低非特異性結合以及與纖維素基質的生 物相容性,使它更適合用于這一目的.Nus.Tag、 Trx.Tag和GST.Tag序列用來增加其融合伴侶的溶解性.Nus.Tag和Trx.Tag載體與利于在胞漿中形成二硫鍵的Origami宿主菌相容.各種融合標簽和相應pET載體見列表.一些 pET載體帶有數(shù)個串聯(lián)的融合標簽,作為 5'融合伴侶.此外,許多載體通

22、過目標基因序列符合讀碼框的通讀而表達末端帶有不同多肽標 簽的融合蛋白.使用在 5'標簽和目標序列之間含有蛋白酶切割位點凝血酶、因子 Xa和 腸激酶的載體,可以在純化后選擇性去除一個或多個標簽.pET-30 Ek/LIC 、 pET-32Ek/LIC、pET-34 Ek/LIC 和pET-36 Ek/LIC 是細胞定位和親和標簽配置良好的代表.pETEk/LIC載體Combo試劑盒包才所有 4種即用型載體,可直接用于構建數(shù)種目標基因構型.pET NusA融合系統(tǒng)43.1在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性活性蛋白新推出的pET NusA融合系統(tǒng)設計用于克隆和高水平表達與495aa NusA Nus.T

23、ag 蛋白融合的多肽序列.對數(shù)據(jù)庫中4000個以上蛋白進行可溶性建模,NusA蛋白被確認為具有最高的可溶性.在用四種不同NusA融合蛋白進行的試驗中,大于 85%的表達蛋白都是可溶的. pET-43.1載體含有Nus.Tag融合伴侶并與trx/gor突變體 Origami和OrigamiB菌株相容,有利于在胞漿中形成二硫鍵.使用pET-43.1載體和這些trx/gor宿主菌組合可能獲得二硫鍵結合的蛋白.優(yōu)點 高可溶性的 N-末端Nus.Tag融合伴侶 上游 His.Tag a、 S.Tag和可選擇的 C-末端 HSV.Tag a、 His.Tag融合標簽 凝血酶和腸激酶切割位點 多克隆位點位于

24、所有讀碼框中 與AD494和Origami宿主菌株相容,可促進表達蛋白的正確折迭pET宿主菌株感受態(tài)細胞所有pET系統(tǒng)宿主菌以預測試的感受態(tài)細胞形式提供,可立即用于轉化.DE3 指宿主為 入DE3溶原菌,其染色體上帶有一拷貝由lacUV5啟動子限制的T7 RNA聚合酶基因.這類菌株適用于從克隆到pET載體的目標基因生產(chǎn)蛋白.命名為pLysS和pLysE的宿主菌帶有編碼 T7溶菌酶為 T7 RNA聚合酶的天然抑制物的 pET相容性質粒.帶有 pLysS的細胞產(chǎn)生少量溶菌酶,而 pLysE宿主菌產(chǎn)生更大量酶. 這些菌株用于在誘導前抑制T7 RNA聚合酶的根底表達,這樣可以穩(wěn)定編碼影響細胞生長和活力

25、的目標蛋白的pET重組體.帶有 pLacI的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制pETBlue和pTriEx載體根底表達的lac阻遏蛋白.入DE3溶原化試劑盒用于制備其它遺傳背景的新 表達宿主菌.AD494菌株為硫氧還蛋白復原酶 trxB 突變菌株,能夠在胞漿內(nèi)形成二硫鍵,提供了生 產(chǎn)正確折迭的活性蛋白的潛力.TrxB突變可用卡那霉素選擇,因此該菌株建議用于帶氨芳抗性標記 bla的質粒.B834為BL21的親本菌株.這些蛋白酶缺陷宿主菌為甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型,可用35 S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標蛋白進行高特異活性標記,從而用于結晶學研究.BL21應用最廣的宿主菌來源,具有 lon和ompT蛋白酶缺陷的優(yōu)點

26、.BL21 TrxB菌株在蛋白酶缺陷BL21背景上具有與 AD494菌株相同的硫氧還蛋白復原酶突變trxB .由于trxB宿主有利于胞漿內(nèi)二硫鍵形成,它們的使用可增加正確折迭的蛋 白組分.TrxB突變可用卡那霉素選擇,因此該菌株建議用于帶氨節(jié)抗性標記bla的質粒.BLR為BL21的recA -衍生菌株,能夠改善質粒單體產(chǎn)量,有助于穩(wěn)定含有重復序列或 其產(chǎn)物能夠引起 DE3噬菌體喪失的目標質粒.HMS174菌株在 K-12背景上提供了 recA突變.與 BLR 一樣,這些菌株能夠穩(wěn)定其產(chǎn) 物能夠引起 DE3噬菌體喪失的某些目標基因.NovaBlue適合 用作初始克隆宿主菌的K-12菌株,具有高轉化效率、藍 /白斑篩選水平與適宜質粒和導致優(yōu)質質粒 DNA高產(chǎn)的recA endA突變.由于存在 F附加