pet表達(dá)系統(tǒng)文檔良心出品

1、對(duì)于全世界許多研究者,Novagen的pET系統(tǒng)已成為在大腸桿菌中蛋白表達(dá)的首選.該系統(tǒng)成功的一個(gè)主要原因是目標(biāo)基因被克隆到不為大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別的 T7啟動(dòng)子之下,因此在參加T7 RNA聚合酶之前幾乎沒(méi)有表達(dá)發(fā)生.克隆到 pET載體的基因?qū)嶋H上是被關(guān)閉的,不會(huì)由于產(chǎn)生的蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性而引起質(zhì)粒不穩(wěn)定.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到染色體上含有一拷貝由lacUV5限制的 T7 RNA聚合酶基因的表達(dá)宿主中,并通過(guò)參加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；也可通過(guò) l CE6感染原始克隆宿主菌來(lái)提供T7 RNA 聚合酶.使用大腸桿菌啟動(dòng)子系統(tǒng) (如tac、lac、 trc、 pL)有困難的許多基因已經(jīng)在pET系統(tǒng)中穩(wěn)定克隆

2、和表達(dá).T7 RNA聚合酶的選擇性和活性使得幾乎所有細(xì)胞資源都用于為目標(biāo)基因表 達(dá).誘導(dǎo)后幾小時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物就可超過(guò)細(xì)胞總蛋白的50%.新開(kāi)發(fā)的T7驅(qū)動(dòng)表達(dá)技術(shù)以 pETBlue TM系統(tǒng)為代表.pETBlue載體包括了 pET 用于表達(dá)的優(yōu)點(diǎn),在目標(biāo)基因克隆和質(zhì)粒DNA操作的方面更為方便.pETBlue TM 系統(tǒng)：新一代 T7表達(dá)載體pETBlue載體代表了新型表達(dá)載體,它具備所有廣受歡送的克隆載體的最理想特點(diǎn)和T7驅(qū)動(dòng)蛋白表達(dá)的完全功能.目標(biāo)基因以相對(duì)于修飾的大腸桿菌tet啟動(dòng)子的反義方向插到lacZ a -肽編碼區(qū),因此可進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選.正確定位于目標(biāo)基因正義方向上游的T7轉(zhuǎn)錄和譯信號(hào)使

3、表達(dá)成為可能.與標(biāo)準(zhǔn)pET載體一樣,通過(guò)轉(zhuǎn)化入DE3溶原菌并用IPTG誘導(dǎo)或通過(guò)l CE6感染原始宿主菌生產(chǎn)目標(biāo)蛋白.優(yōu)點(diǎn) 藍(lán)/白斑篩選,便于克隆 高拷貝數(shù),質(zhì)粒 DNA高產(chǎn) 以AccepTor TM載體或perfectly Blunt a載體形式提供,便于快速PCR克隆 目標(biāo)基因無(wú)根底水平表達(dá),消除了毒性基因產(chǎn)物相關(guān)的質(zhì)粒不穩(wěn)定性 表達(dá)水平與經(jīng)典 pET載體相同 用Tuner TM (DE3)pLacI宿主菌實(shí)現(xiàn)真正的表達(dá)水平“變阻器限制.PET系統(tǒng)：大腸桿菌中蛋白表達(dá)的金字招牌pET載體中,目標(biāo)基因克隆到 T7噬菌體強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和譯信號(hào)限制之下,并通過(guò)在宿主細(xì)胞提供T7 RNA聚合酶來(lái)誘導(dǎo)表達(dá).

4、Novagen的pET系統(tǒng)不斷擴(kuò)大,提供了用于表達(dá)的新技術(shù)和選擇,目前共包括36種載體類(lèi)型、15種不同宿主菌和設(shè)計(jì)用于有效檢測(cè)和純 化目標(biāo)蛋白的許多其它相關(guān)產(chǎn)品.優(yōu)點(diǎn) 是原核蛋白表達(dá)引用最多的系統(tǒng),在任何大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,根底表達(dá)水平最低 真正的調(diào)節(jié)表達(dá)水平的“變阻器限制 提供各種不同融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)配置 可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運(yùn)和多肽生產(chǎn)等專(zhuān)用載體和宿主菌 許多載體以LIC載體試劑盒提供,用于迅速定向克隆PCR產(chǎn)物 許多宿主菌株以感受態(tài)細(xì)胞形式提供,可立即用于轉(zhuǎn)化陽(yáng)性pFORCE TM克隆系統(tǒng)具有高效克隆PCR產(chǎn)物、陽(yáng)性選擇重組體和高水平表達(dá)目標(biāo)蛋白等特點(diǎn).pETBlue T

5、M 系統(tǒng)T7驅(qū)動(dòng)的嚴(yán)緊限制表達(dá)、藍(lán) /白斑篩選、質(zhì)粒產(chǎn)量高新奇的pETBlue TM系統(tǒng)兼有廣受歡送的藍(lán) /白斑篩選載體所具有的通過(guò)目測(cè)確定 重組體和高質(zhì)?？截悢?shù),以及pET載體嚴(yán)緊限制的高蛋白表達(dá)等特點(diǎn).藍(lán)/白斑篩選通過(guò)使用弱組成型大腸桿菌啟動(dòng)子tet 驅(qū)動(dòng)lacZ a -肽表達(dá)而實(shí)現(xiàn),而目標(biāo)基因表達(dá)由相反方向的T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng).目標(biāo)序列插入多克隆位點(diǎn) MCS 破壞了 lacZ a -肽的表達(dá), 在NovaBlue菌株中當(dāng)存在 x-gal時(shí)產(chǎn)生白菌落表型,而帶有非重組載體的菌落變藍(lán).由 于T7驅(qū)動(dòng)的蛋白表達(dá)要求插入片段克隆到相對(duì)于tet啟動(dòng)子的反義方向,因此實(shí)際上沒(méi)有目標(biāo)序列的根底表達(dá).相對(duì)于

6、 pET載體,pETBlue質(zhì)粒上高拷貝PUC復(fù)制起點(diǎn)增加了質(zhì)粒產(chǎn)量,為測(cè)序、突變和其它質(zhì)粒操作帶來(lái)方便.如果插入序列相對(duì)于 T7 lac啟動(dòng)子為正義方向且符合每個(gè)載體的譯要求,pETBlue載體中目標(biāo)基因可以高水平表達(dá).用兩種方法進(jìn)行蛋白表達(dá)：用 l CE6 l pL啟動(dòng)子限制T7 RNA聚合酶表達(dá)的噬菌體感染,或轉(zhuǎn)化重組pETBlue質(zhì)粒到宿主菌Tuner TMDE3pLacI或 Origami TM DE3pLacI 中并用IPTG 誘導(dǎo).這些宿主菌染色體上帶有一拷 貝lacUV5限制的T7 RNA聚合酶基因,并通過(guò)相容的pLacI質(zhì)粒提供足夠lac阻遏蛋白,以保證低水平的未誘導(dǎo)表達(dá).T

7、uner菌株的lacY狀態(tài)使整個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞被均一的誘導(dǎo),并隨IPTG劑量誘導(dǎo)有不同的蛋白表達(dá)水平. Origami菌株能夠增強(qiáng)胞質(zhì)中二硫鍵形成.pETBlue-1pETBlue-1便于從5'端編碼開(kāi)放讀碼框架的插入片段表達(dá)未融合的天然蛋白.該載 體EcoR V GATATC克隆位點(diǎn)位于強(qiáng) T7基因10核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS 附近.含有 ATG起始密碼子或 5'端具有一個(gè)位置適宜的G核甘酸插入片段成為一個(gè)適宜的大腸桿菌譯起始位點(diǎn).pETBlue-2pETBlue-2提供了載體編碼的ATG起始密碼子和多種下游克隆位點(diǎn).MCS 5'和3'端兩套各三個(gè)重疊平末端酶切位點(diǎn)便于

8、將任何插入片段克隆到讀碼框中.在載體確定的讀碼框中,這些酶產(chǎn)生的平末端終止于密碼三聯(lián)體的不同位置.因此只要插入方向正確,任何插入片段可克隆到經(jīng)過(guò)適宜平末端酶切割的載體的讀碼框中.而且,任何不含內(nèi)部終止密碼子的插入片段都可與 C-末端HSV.Tag a表位和His.Tag a序列克隆到同一讀碼框中.pETBlue TM PCR克隆試齊盒方便地將 PCR擴(kuò)增DNA直接克隆到 pETBlue載體中除了含有未切割質(zhì)粒的 pETBlue TM系統(tǒng), Novagen還提供可立即插入 PCR產(chǎn)物的 pETBlue載體.已有兩種試劑盒： AccepTor TM載體試劑盒能夠插入帶單個(gè) 3' -dA突出

9、 的DNA,如非校對(duì) DNA 聚合酶如Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物；而perfectly Blunt a克隆試劑盒設(shè)計(jì)用于克隆任何末端形式的插入片段.在pETBlue-1 AccepTor載體中表達(dá)插入基因的引物設(shè)計(jì)：pETBlue-1 :用5'端ATG開(kāi)始的正義引物進(jìn)行擴(kuò)增,能夠保證在大腸桿菌中有效合成蛋 白的RBS和譯起始位點(diǎn)之間的最適距離.目標(biāo)序列竣基端引物設(shè)計(jì)沒(méi)有限制.Met-正義弓 I 物 5' -ATG XXX -反義引物無(wú)限制 pET系統(tǒng)概述pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng).根據(jù)最初由Studier等開(kāi)發(fā)的T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)系統(tǒng),Novagen

10、的pET系統(tǒng)已用于表達(dá)成千上萬(wàn)種不同蛋白.限制根底表達(dá)水平pET系統(tǒng)提供6種載體-宿主菌組合,能夠調(diào)節(jié)根底表達(dá)水平以?xún)?yōu)化目標(biāo)基因的表達(dá).沒(méi)有單一策略或條件適用于所有目標(biāo)蛋白,所以進(jìn)行優(yōu)化選擇是必要的.宿主菌株質(zhì)粒在非表達(dá)宿主菌中構(gòu)建完成后,通常轉(zhuǎn)化到一個(gè)帶有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌入DE3溶原菌中表達(dá)目標(biāo)蛋白.在 入DE3溶原菌中,T7 RNA聚合酶基因由lacUV5啟動(dòng)子限制.未誘導(dǎo)時(shí)便有一定程度轉(zhuǎn)錄,因此適合于表達(dá)其產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng) 無(wú)毒害作用的一些基因.而宿主菌帶有pLysS和pLyE時(shí)調(diào)控會(huì)更嚴(yán)緊. pLys質(zhì)粒編碼T7溶菌酶,它是T7 RNA聚合酶的天然抑制物,因此可降低其在

11、未誘導(dǎo)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基 因的水平.pLysS宿主菌產(chǎn)生低量T7溶菌酶,而 pLysE宿主菌產(chǎn)生更多酶,因此是最嚴(yán)緊限制的 入DE3溶原菌.有11種不同DE3溶原化宿主菌.使用最廣泛的為 BL21及其衍生菌株,它的優(yōu)點(diǎn)在于缺 失lon和ompT蛋白酶.B834菌株為甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型,因此可用35 S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行高特異活性標(biāo)記.BLR為recA -衍生菌株,改善了質(zhì)粒單體產(chǎn)量,有助于穩(wěn)定含有重復(fù)序列的目標(biāo)質(zhì)粒.兩個(gè)硫氧還蛋白復(fù)原酶trxB 突變菌株AD494,BL21 trxB ,有利于大腸桿菌胞漿中二硫鍵形成.Origami TM 和OrigamiB 菌株為trxB/

12、gor雙突變,這兩個(gè)酶是主要復(fù)原途徑的關(guān)鍵酶.Origami和OrigamiB宿主菌的主要優(yōu)點(diǎn)是能形成正確折迭的含有二硫鍵的蛋白.新的Rosetta TM菌株補(bǔ)充了四種大腸桿菌稀有密碼子的 tRNA ,改善了由于密碼子使用頻率不同而引起的一些真核蛋白低表達(dá).其它菌株背景包括K-12菌株HMS174和NovaBlue ,象BLR 一樣為recA -.這些菌株可穩(wěn)定表達(dá)其產(chǎn)物可能導(dǎo)致DE3噬菌體喪失的某些目標(biāo)基因.由于存在 F附加體編碼的高親和力lacIq阻遏蛋白,NovaBlue為一個(gè)有用的嚴(yán)緊型宿主菌.此外, Novagen提 供了入DE3溶原化試劑盒,用于制備其它遺傳背景的新表達(dá)宿主菌.表達(dá)

13、高毒性基因或 制備新的 入DE3溶原菌的另一替代方法是通過(guò)l CE6感染提供T7 RNA聚合酶.雖然不如用IPTG誘導(dǎo) 入DE3溶原菌方便,這種策略也被優(yōu)先用于一些應(yīng)用中.高嚴(yán)緊性T7 lac啟動(dòng)子除了在宿主菌水平選擇三種根本的表達(dá)嚴(yán)緊性,pET系統(tǒng)中T7啟動(dòng)子本身提供了兩種不同的嚴(yán)緊性選擇：普通 T7啟動(dòng)子和 T7 lac啟動(dòng)子.T7 lac啟動(dòng)子在啟動(dòng)子區(qū)下游17bp處含有一個(gè) 25bp的lac操縱序列.該位點(diǎn)結(jié)合lac阻遏蛋白能夠有效降低T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄,這樣提供了在入DE3溶原菌中抑制根底表達(dá)的第二種基于lacI的機(jī)制除了抑制lacUV5 .含T7 lac啟動(dòng)子的pET質(zhì)粒還具

14、有它們自己的 lacI ,保證足夠的阻遏 蛋白結(jié)合到操縱基因位點(diǎn)上.在實(shí)際應(yīng)用中,為了獲得最高產(chǎn)量的蛋白,通常應(yīng)該測(cè)試多種不同的載體/宿主菌組合.限制誘導(dǎo)的表達(dá)水平在許多情況下,表達(dá)活性可溶性最好的蛋白依賴(lài)于宿主細(xì)胞的背景、培養(yǎng)條件和適宜的載體配置.通常,目標(biāo)蛋白活性最高的條件與產(chǎn)量最高的條件不一致.除了根據(jù)載體/宿主菌組合限制T7 RNA聚合酶的根底表達(dá)提供不同嚴(yán)緊性,pET系統(tǒng)還根據(jù)誘導(dǎo)物 IPTG 濃度,對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)提供了真正的“變阻器限制. Tuner和OrigamiB宿主菌的lacY 突變使這種限制成為可能.選才i pET載體所有的pET載體均來(lái)自pBR322,但彼此間先導(dǎo)序列、

15、表達(dá)信號(hào)、融合標(biāo)簽、相關(guān)限制性 位點(diǎn)和其它特點(diǎn)有所不同.有兩大類(lèi)pET質(zhì)粒,即轉(zhuǎn)錄載體和譯載體：轉(zhuǎn)錄載體包括 pET-21、pET-23和pET-24 表達(dá)目標(biāo) RNA,但不提供譯信號(hào).它 們用于從自身帶有細(xì)菌譯信號(hào)的目標(biāo)基因表達(dá)蛋白.注意：轉(zhuǎn)錄載體通過(guò)命名后面的一個(gè)缺失字母后綴加以區(qū)分譯載體含有設(shè)計(jì)用于蛋白表達(dá)的有效譯起始信號(hào).許多載體在讀碼框a、 b和c中帶有克隆位點(diǎn),分別對(duì)應(yīng)于BamH I位點(diǎn)的GGA、 GAT和ATC三聯(lián)體.選擇要點(diǎn)選擇用于表達(dá)的 pET載體通常涉及多種因素.考慮以下三個(gè)主要因素： 所表達(dá)蛋白的用途 所表達(dá)蛋白的信息 克隆策略pET載體表達(dá)的蛋白用途各種各樣.例如,表達(dá)

16、量為分析級(jí)的蛋白可用于活性研究、突變體篩選和定性、篩選配體相互作用和抗原制備.大量活性蛋白用于結(jié)構(gòu)研究、試劑或親和基 質(zhì)制備.許多載體適合表達(dá)用于篩選或抗原制備的分析量蛋白,然而只有載體、宿主菌和培養(yǎng)條件組合十分適宜才可能用于大量純化.如果需要活性蛋白連續(xù)高產(chǎn),應(yīng)該試驗(yàn)多種載體、宿主菌和培養(yǎng)條件組合以找到最優(yōu)化結(jié)果.任何關(guān)于目標(biāo)蛋白的信息都有助于載體選擇.例如,一些蛋白的活性要求一個(gè)或兩個(gè)末端沒(méi)有外源序列.許多pET載體能夠克隆非融合序列,然而如果特定譯起始序列不能在大腸桿菌中有效利用,表達(dá)水平可能受影響.在這些情況下,?？捎糜行П磉_(dá)的氨基末端序 列構(gòu)建融合蛋白,然后在純化后用位點(diǎn)特異性蛋白酶

17、消化去除融合序列.LIC 連接非依賴(lài)的克隆策略對(duì)這種方法特別有用,由于克隆操作通過(guò)腸激酶和因子X(jué)a能夠去除所有氨基端載體編碼序列.由于限制性位點(diǎn)和讀碼框相容性的需要,克隆策略也會(huì)影響載體選擇.由于許多pET載體具有共同的限制性位點(diǎn)配置,通?？赡軐⒁淮沃苽涞哪繕?biāo)基因克隆到幾個(gè)載體中.采PCR克隆策略時(shí)那么有不同的考慮.LIC載體試劑盒推薦用于此目的,可通過(guò) PCR制備插入片段,而不需要限制性消化載體或插入片段.溶解性和細(xì)胞定位考慮了目標(biāo)蛋白的應(yīng)用和克隆策略,還應(yīng)該確定目標(biāo)蛋白的細(xì)胞定位和溶解性,這一點(diǎn)十分重要.在許多實(shí)際應(yīng)用中常希望表達(dá)可溶的活性蛋白.特定目標(biāo)蛋白的溶解性取決于多種因素,包括各自

18、的蛋白序列. 在許多情況下,溶解性不是有或無(wú)的現(xiàn)象,載體、宿主菌和培養(yǎng)條件可被用來(lái)增加或減少獲得的可溶或不可溶形式的比 例.PET-32載體系列使目標(biāo)序列與通常能夠增加可溶性蛋白比例的硫氧還蛋白Trx.Tag 融合.新推出的pET-43.1系列具有通過(guò)大量系統(tǒng)篩選而得到的一種過(guò)量表達(dá)時(shí)具有極高溶 解性的大腸桿菌蛋白-Nus.Tag融合伴侶,從而進(jìn)一步提升了目標(biāo)蛋白的可溶性.此外,trxB 突變株 AD494 和 BL21 trxB ,或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞 漿中形成許多真核蛋白正確折迭和活性所要求的二硫鍵.低溫誘導(dǎo)15 -25. C 也可

19、增加可溶性目標(biāo)蛋白的比例.獲得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周質(zhì)中,為折迭和二硫鍵形成有更適宜的環(huán)境.為了到達(dá)這一目的,通常使用帶信號(hào)肽的載體.一些純化策略可以?xún)?yōu)化胞質(zhì)中不溶性包涵體的產(chǎn)量.抽提包涵體并溶解,然后目標(biāo)蛋白在體外重新折迭如使用Novagen的蛋白折迭試劑盒.該過(guò)程通常產(chǎn)生高產(chǎn)量初始蛋白并預(yù)防宿主細(xì)胞中的蛋白降解.然而,重新折迭成活性蛋白的效率隨不同蛋白變化很大,可能相當(dāng)?shù)?pET-31b + 載體專(zhuān)為產(chǎn)生不可溶融合蛋白而設(shè)計(jì),提供了生產(chǎn)小蛋白和多肽的有效方法.滿(mǎn)足不同需要的融合標(biāo)簽如果融合序列不影響應(yīng)用, 生產(chǎn)帶有 S.Tag、T7.Tag a、His.Tag a和H

20、SV.Tag a的融合 蛋白會(huì)很方便后續(xù)操作,并易于通過(guò)蛋白雜交檢測(cè).這些多肽融合序列很小,它們的檢測(cè)試劑極特異和靈敏.通過(guò)使用相應(yīng)樹(shù)脂和緩沖液試劑盒,GST.Tag、S.Tag和T7.Tag序列可用于親和純化.使用S.Tag和GST.Tag分析試劑盒可對(duì)粗提或純化的融合蛋白準(zhǔn)確定量.采用一種新奇底物的FRETWorks S.Tag分析試劑盒可通過(guò)熒光檢測(cè)到少于1fmol的融合蛋白.His.Tag a序列作為純化蛋白的融合伴侶非常有用,尤其對(duì)那些以包涵體形式表達(dá)的蛋白來(lái) 說(shuō),它可以使親和純化可在溶解蛋白的完全變性條件下進(jìn)行.CBD.Tag a在低費(fèi)用親和純化中非常有用.它們也特另U適用于重新折

21、迭特別是帶有CBDclos .Tag a序列的pET-34b + 和35b + .由于只有正確重新折迭的CBDs結(jié)合到纖維素基質(zhì)上,CBIND親和純化步驟能夠從制備物中去除不正確折迭的分子.任何標(biāo)簽可用于固定目標(biāo)蛋白,但由于CBD.Tag序列的低非特異性結(jié)合以及與纖維素基質(zhì)的生 物相容性,使它更適合用于這一目的.Nus.Tag、 Trx.Tag和GST.Tag序列用來(lái)增加其融合伴侶的溶解性.Nus.Tag和Trx.Tag載體與利于在胞漿中形成二硫鍵的Origami宿主菌相容.各種融合標(biāo)簽和相應(yīng)pET載體見(jiàn)列表.一些 pET載體帶有數(shù)個(gè)串聯(lián)的融合標(biāo)簽,作為 5'融合伴侶.此外,許多載體通

22、過(guò)目標(biāo)基因序列符合讀碼框的通讀而表達(dá)末端帶有不同多肽標(biāo) 簽的融合蛋白.使用在 5'標(biāo)簽和目標(biāo)序列之間含有蛋白酶切割位點(diǎn)凝血酶、因子 Xa和 腸激酶的載體,可以在純化后選擇性去除一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽.pET-30 Ek/LIC 、 pET-32Ek/LIC、pET-34 Ek/LIC 和pET-36 Ek/LIC 是細(xì)胞定位和親和標(biāo)簽配置良好的代表.pETEk/LIC載體Combo試劑盒包才所有 4種即用型載體,可直接用于構(gòu)建數(shù)種目標(biāo)基因構(gòu)型.pET NusA融合系統(tǒng)43.1在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性活性蛋白新推出的pET NusA融合系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于克隆和高水平表達(dá)與495aa NusA Nus.T

23、ag 蛋白融合的多肽序列.對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中4000個(gè)以上蛋白進(jìn)行可溶性建模,NusA蛋白被確認(rèn)為具有最高的可溶性.在用四種不同NusA融合蛋白進(jìn)行的試驗(yàn)中,大于 85%的表達(dá)蛋白都是可溶的. pET-43.1載體含有Nus.Tag融合伴侶并與trx/gor突變體 Origami和OrigamiB菌株相容,有利于在胞漿中形成二硫鍵.使用pET-43.1載體和這些trx/gor宿主菌組合可能獲得二硫鍵結(jié)合的蛋白.優(yōu)點(diǎn) 高可溶性的 N-末端Nus.Tag融合伴侶 上游 His.Tag a、 S.Tag和可選擇的 C-末端 HSV.Tag a、 His.Tag融合標(biāo)簽 凝血酶和腸激酶切割位點(diǎn) 多克隆位點(diǎn)位于

24、所有讀碼框中 與AD494和Origami宿主菌株相容,可促進(jìn)表達(dá)蛋白的正確折迭pET宿主菌株感受態(tài)細(xì)胞所有pET系統(tǒng)宿主菌以預(yù)測(cè)試的感受態(tài)細(xì)胞形式提供,可立即用于轉(zhuǎn)化.DE3 指宿主為 入DE3溶原菌,其染色體上帶有一拷貝由lacUV5啟動(dòng)子限制的T7 RNA聚合酶基因.這類(lèi)菌株適用于從克隆到pET載體的目標(biāo)基因生產(chǎn)蛋白.命名為pLysS和pLysE的宿主菌帶有編碼 T7溶菌酶為 T7 RNA聚合酶的天然抑制物的 pET相容性質(zhì)粒.帶有 pLysS的細(xì)胞產(chǎn)生少量溶菌酶,而 pLysE宿主菌產(chǎn)生更大量酶. 這些菌株用于在誘導(dǎo)前抑制T7 RNA聚合酶的根底表達(dá),這樣可以穩(wěn)定編碼影響細(xì)胞生長(zhǎng)和活力

25、的目標(biāo)蛋白的pET重組體.帶有 pLacI的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制pETBlue和pTriEx載體根底表達(dá)的lac阻遏蛋白.入DE3溶原化試劑盒用于制備其它遺傳背景的新 表達(dá)宿主菌.AD494菌株為硫氧還蛋白復(fù)原酶 trxB 突變菌株,能夠在胞漿內(nèi)形成二硫鍵,提供了生 產(chǎn)正確折迭的活性蛋白的潛力.TrxB突變可用卡那霉素選擇,因此該菌株建議用于帶氨芳抗性標(biāo)記 bla的質(zhì)粒.B834為BL21的親本菌株.這些蛋白酶缺陷宿主菌為甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型,可用35 S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行高特異活性標(biāo)記,從而用于結(jié)晶學(xué)研究.BL21應(yīng)用最廣的宿主菌來(lái)源,具有 lon和ompT蛋白酶缺陷的優(yōu)點(diǎn)

26、.BL21 TrxB菌株在蛋白酶缺陷BL21背景上具有與 AD494菌株相同的硫氧還蛋白復(fù)原酶突變trxB .由于trxB宿主有利于胞漿內(nèi)二硫鍵形成,它們的使用可增加正確折迭的蛋 白組分.TrxB突變可用卡那霉素選擇,因此該菌株建議用于帶氨節(jié)抗性標(biāo)記bla的質(zhì)粒.BLR為BL21的recA -衍生菌株,能夠改善質(zhì)粒單體產(chǎn)量,有助于穩(wěn)定含有重復(fù)序列或 其產(chǎn)物能夠引起 DE3噬菌體喪失的目標(biāo)質(zhì)粒.HMS174菌株在 K-12背景上提供了 recA突變.與 BLR 一樣,這些菌株能夠穩(wěn)定其產(chǎn) 物能夠引起 DE3噬菌體喪失的某些目標(biāo)基因.NovaBlue適合 用作初始克隆宿主菌的K-12菌株,具有高轉(zhuǎn)化效率、藍(lán) /白斑篩選水平與適宜質(zhì)粒和導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒 DNA高產(chǎn)的recA endA突變.由于存在 F附加