rBTI的內(nèi)化及誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞自噬的研究

1、rBTI的內(nèi)化及誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞自噬的研究【摘要】：蛋白酶抑制劑廣泛分布于自然界中,以不同形式存在于植物,動(dòng)物及微生物體內(nèi),是一類可以作用于蛋白酶,并對(duì)酶有特異性抑制作用的小分子物質(zhì)或蛋白質(zhì)。它們按一定比例與酶結(jié)合形成可逆的蛋白質(zhì)復(fù)合物,在血液凝固,補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng),細(xì)胞凋亡的調(diào)控以及激素加工處理等過程中發(fā)揮重要的作用。蕎麥胰蛋白酶抑制劑(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是由69個(gè)氨基酸組成的分子量為7.9kD的耐熱小分子蛋白,屬于PotatoI型蛋白酶抑制劑家族。本課題組的前期研究表明,重組的蕎麥胰蛋白酶抑制劑(recombinantBuckwheatTrypsi

2、nInhibitor,rBTI),對(duì)HepG2,EC9706,K562,HL60等腫瘤細(xì)胞株都有明顯的抑制生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡的作用,而對(duì)正常肝細(xì)胞HL7702沒有影響；rBTI可以誘導(dǎo)促凋亡基因表達(dá)上調(diào),抗凋亡基因表達(dá)下降,可以使EC9706細(xì)胞周期阻滯于Go/G1期,但是具體的分子機(jī)制還不清楚。本研究選用pExSecI表達(dá)載體,構(gòu)建了含有BTI基因的表達(dá)質(zhì)粒pExSecI-BTI,經(jīng)原核表達(dá)和純化,獲得了無融合標(biāo)簽的rBTI,分析了rBTI內(nèi)化進(jìn)入HepG2細(xì)胞的機(jī)制,探討了其誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬的分子機(jī)制,以及與細(xì)胞表面的可能受體uPA的相互作用。主要結(jié)果如下：1.構(gòu)建了原核表達(dá)載體pEx

3、Sec-BTI,并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0.5mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間為3.5h時(shí),rBTI的表達(dá)量最高。根據(jù)rBTI執(zhí)穩(wěn)定性好的特點(diǎn),對(duì)rBTI的純化條件進(jìn)行了優(yōu)化(80熱處理20min),經(jīng)ResourceTMQ離子交換層析一步純化即可獲得純度大于95%的rBTI。這一純化步驟應(yīng)用于rBTI的大規(guī)模制備亦十分有效。2.將rBTI用FITC標(biāo)記,綜合運(yùn)用多種內(nèi)吞抑制劑及方法,如NH4CI,MDC,K+,蔗糖溶液等,以及RNA干擾,M期阻滯等技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡研究了rBTI進(jìn)入HepG2細(xì)胞的方式。提出rBTI以細(xì)胞膜上尿激酶型纖溶酶原激活子(uPA)為受體,通過網(wǎng)

4、格蛋白依賴性的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,呈現(xiàn)濃度和能量依賴性,其中細(xì)胞膜電位在內(nèi)吞過程中起著重要作用。3.采用透射電子顯微鏡,MDC染色,流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)研究了rBTI誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞自噬。rBTI作用HepG2細(xì)胞后,透射電子顯微鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)自噬體以及自噬溶酶體結(jié)構(gòu),細(xì)胞發(fā)生了自噬,細(xì)胞的自噬活性與rBTI的濃度呈正相關(guān)。通過MDC染色以及pCMV-GFP-LC3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步確定了rBTI可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬,當(dāng)rBTI誘導(dǎo)4h后,HepG2細(xì)胞即發(fā)生明顯的自噬現(xiàn)象。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察了rBTI作用前后胞內(nèi)細(xì)胞器的變化。在rBTI作用12h后,HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體發(fā)生較

5、大的變化,線粒體膜的通透性發(fā)生改變,但是細(xì)胞核的變化不明顯。通過自噬抑制劑3-MA的聯(lián)合使用以及細(xì)胞恢復(fù)實(shí)驗(yàn)等方法,明確了rBTI誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要是自噬性程序性細(xì)胞死亡。4.構(gòu)建了pEGFP-N1-BTI單色熒光載體及pDsRed1-N1-EGFP-BTI雙色熒光載體,觀察了rBTI在HepG2細(xì)胞內(nèi)的定位,確定了rBTI主要定位于胞質(zhì)中的自噬體及自噬溶酶體。據(jù)此我們提出假說：作為外源物的rBTI被細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)分子選擇性識(shí)別,進(jìn)入自噬溶酶體被降解,過度的自噬誘發(fā)細(xì)胞失去固有的穩(wěn)態(tài),進(jìn)而走向死亡。即rBTI介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種底物特異性的死亡機(jī)制。通過RT-PCR的方法,對(duì)rBTI作用后三

6、個(gè)自噬相關(guān)分子(mTOR,Beclinl和PI3K)進(jìn)行了RNA水平的分析,結(jié)合3-MA抑制劑實(shí)驗(yàn),初步確定rBTI誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬主要受Beclin1復(fù)合物的調(diào)控。5.通過熒光光譜法、凝膠電泳法等,進(jìn)一步確定了rBTI與uPA之間存在相互作用。在體外條件下,rBTI可作為uPA的底物,被uPA水解為兩個(gè)片段。采用RT-PCR的方法,對(duì)rBTI作用后,uPA以及uPA下游兩個(gè)分子(MMP-2和MMP-9)進(jìn)行了檢測(cè),并通過明膠酶譜和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究了rBTI對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明,rBTI可以誘導(dǎo)uPA,MMP-2和MMP-9的表達(dá),并促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移?！娟P(guān)鍵詞】：蕎麥胰蛋白

7、酶抑制劑Potato型抑制劑細(xì)胞自噬尿激酶型纖溶酶原激活子抗腫瘤【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：博士【學(xué)位授予年份】：2012【分類號(hào)】：Q25【目錄】：中文摘要14-16ABSTRACT16-19第一章文獻(xiàn)綜述19-481蛋白酶抑制劑概述19-241.1蛋白酶抑制劑的分類及特征19-221.1.1Bowman-Birk型抑制劑(BBI)19-201.1.2Kunitz型抑制劑20-211.1.3Potato型抑制劑21-221.2蛋白酶抑制劑的生理功能22-231.2.1營(yíng)養(yǎng)積累221.2.2調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白酶活性221.2.3抵御病蟲害22-231.3蛋白酶抑制劑的應(yīng)用23-241.3

8、.1在轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用231.3.2在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用23-242細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展24-382.1細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)特征及分類24-252.2細(xì)胞自噬的信號(hào)調(diào)控25-312.2.1MTOR復(fù)合物調(diào)控26-302.2.1.1PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路282.2.1.2AMPK/mTOR信號(hào)通路282.2.1.3mTOR對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控28-302.2.2Beclin1的復(fù)合體調(diào)控30-312.3參與細(xì)胞自噬的相關(guān)分子及其功能31-352.4細(xì)胞自噬研究方法35-372.4.1電子顯微鏡35-362.4.2Monodansylcadaverine染色362.4.3細(xì)胞自噬的特異標(biāo)志物36

9、2.4.3.1GFP-LC3定位362.4.3.2LC3-到LC3-的轉(zhuǎn)化362.4.4Beclin1的表達(dá)36-372.4.5特異抑制劑372.5細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系37-383本研究的立題背景及意義38-403.1研究背景38-393.2研究目的與意義39-404參考文獻(xiàn)40-48第二章pExSecI-BTI載體的構(gòu)建及純化48-561實(shí)驗(yàn)材料48-491.1菌株及質(zhì)粒481.2試劑及儀器48-492實(shí)驗(yàn)方法49-512.1pExSecI-BTI表達(dá)載體的構(gòu)建49-502.2rBTI的表達(dá)與純化502.3rBTI表達(dá)條件的選擇50-512.4rBTI的純化512.5抑制活性的測(cè)定513實(shí)驗(yàn)

10、結(jié)果51-543.1pExSecI-BTI表達(dá)載體的構(gòu)建51-523.2pExSecI-BTI表達(dá)條件的優(yōu)化52-533.3表達(dá)產(chǎn)物的預(yù)處理533.4rBTI純化及純度分析53-543.5rBTI抑制胰蛋白酶活性的測(cè)定544討論54-555參考文獻(xiàn)55-56第三章rBTI的內(nèi)化機(jī)制56-701實(shí)驗(yàn)材料56-571.1細(xì)胞株及試劑561.2實(shí)驗(yàn)儀器56-571.3實(shí)驗(yàn)試劑的配置572實(shí)驗(yàn)方法57-602.1FITC標(biāo)記rBTI57-582.2細(xì)胞培養(yǎng)582.3激光共聚焦標(biāo)本的制作582.4rBTI最佳使用濃度的確定582.5rBTI與轉(zhuǎn)鐵蛋白的共轉(zhuǎn)運(yùn)58-592.6內(nèi)吞抑制劑的使用592.7M期

11、阻滯對(duì)內(nèi)吞的影響592.8RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用592.9rBTI與uPA在細(xì)胞表面的共定位59-603實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-673.1FITC-BTI以能量和濃度依賴性的方式進(jìn)入細(xì)胞603.2FITC-BTI可以和Rho-Tf同步內(nèi)化60-613.3膜電位消除對(duì)FITC-BTI內(nèi)吞的影響613.4內(nèi)吞抑制劑的影響61-643.5M期阻滯抑制了FITC-BTI的內(nèi)吞643.6FITC-BTI依賴網(wǎng)格蛋白64-653.7FITC-BTI和細(xì)胞表面的uPA共定位65-674討論67-685參考文獻(xiàn)68-70第四章rBTI誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬70-821實(shí)驗(yàn)材料70-711.1實(shí)驗(yàn)試劑與質(zhì)粒70-711.2

12、實(shí)驗(yàn)儀器712實(shí)驗(yàn)方法71-732.1細(xì)胞培養(yǎng)712.2透射電鏡觀察712.3rBTI作用后細(xì)胞形態(tài)的變化712.4HepG2細(xì)胞恢復(fù)實(shí)驗(yàn)71-722.5MDC染色722.6pCMV-GFP-LC3轉(zhuǎn)染72-732.7HepG2細(xì)胞自噬的定量檢測(cè)732.8HepG2細(xì)胞自噬對(duì)相關(guān)細(xì)胞器的影響733實(shí)驗(yàn)結(jié)果73-793.1透射顯微鏡觀察HepG2自噬73-743.2細(xì)胞形態(tài)觀察743.3HepG2細(xì)胞恢復(fù)實(shí)驗(yàn)74-763.4MDC染色觀察細(xì)胞自噬763.5GFP-LC3觀察細(xì)胞自噬76-773.6流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)HepG2細(xì)胞自噬773.7HepG2細(xì)胞自噬對(duì)相關(guān)細(xì)胞器的影響77-794討論7

13、9-805參考文獻(xiàn)80-82第五章rBTI誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬機(jī)制初探82-911實(shí)驗(yàn)材料822實(shí)驗(yàn)方法82-862.1雙色熒光載體構(gòu)建82-832.2rBTI在HepG2細(xì)胞內(nèi)的定位832.3rBTI中WXXL模體的突變及活性鑒定83-842.4自噬抑制劑3-MA的使用842.5RNA水平檢測(cè)自噬相關(guān)分子變化84-863實(shí)驗(yàn)結(jié)果86-903.1pDsRed1-N1-EGFP-BTI熒光載體的構(gòu)建86-873.2rBTI分子中WXXL模體的功能87-883.33-MA在rBTI誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬中的作用883.4自噬相關(guān)基因的表達(dá)88-904討論905參考文獻(xiàn)90-91第六章rBTI和uPA相互作用研究91-1001實(shí)驗(yàn)材料912實(shí)驗(yàn)方法91-932.1pGEX-6p-1-BTI載體的構(gòu)建與純化91-922.2熒光光譜法檢測(cè)rBTI與uPA的相互作用922.3凝膠電泳分析rBTI與uPA的相互作用922.4rBTI對(duì)HepG2細(xì)胞uPA及相關(guān)酶表達(dá)的影響92-932.5rBTI對(duì)細(xì)胞