非放射性標記物BrdU研究進展

1、非放射性標記物BrdU研究進展    溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine ,BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入S期細胞單鏈 DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU與胸腺嘧啶競爭摻入的強度可能與細胞增殖異常有關(guān)，如肝癌細胞約11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝細胞僅有1.1%1。既往在分子遺傳學等研究中常采用同位素標記，但有放射污染，技術(shù)難度大，實驗周期長等缺點。近年來非放射性標記物的研究發(fā)展迅速，然而其敏感性多數(shù)不及同位素，使實驗應(yīng)用受限。自82年Gratzer制備出抗BrdU單抗及標記檢測技術(shù)不斷改良提高，應(yīng)用Br

2、dU標記的敏感性已與氘胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）相似2，3。目前認為BrdU是最有希望取代同位素的非放射性標記物之一。本文綜述近年來BrdU研究概況，重點介紹標記過程中有關(guān)技術(shù)問題。 一、標記技術(shù)： 1、劑量和途徑： BrdU可用于體內(nèi)或體外標記，體內(nèi)標記時，實驗鼠按體重60mg-200mg/kg于鼠腹膜下注射4，5，狗按體重100mg/kg靜脈注射6，人體以表面積150g/m2用量，取標本前8.25-10h靜脈注射7，免疫組化檢測。BrdU經(jīng)靜脈給藥一般無副作用，偶有報道過量可致細胞突變。體外標記的研究廣泛而深入，通常將保存在培養(yǎng)液中的新鮮組織剪啐至1-2mm3大小，離心去除了上清液后，加

3、入100g/mlBrdU，或新鮮組織在 0.3mg/ml濃度的BrdU中37攝氏度1小時，然后固定包埋8，細胞標記在RPMI1640-10培養(yǎng)液中進行，細胞數(shù)低于1×106/ml，加入20l的BrdU孵育 209。 2、標本處理： 適當?shù)臉吮咎幚韺rdU染色強度至關(guān)重要。Meyer對450例乳腺癌組織體外標記總結(jié)出3點經(jīng)驗：（1）切組織塊1mm厚；（2）固定前組織有代謝活力；（3）封閉脫氧胸腺核苷合成酶2，因此酶能使脫氧尿苷轉(zhuǎn)變成脫氧胸苷，從而阻止內(nèi)源性脫氧胸苷與BrdU競爭摻入DNA。Xiang最近回顧大量文獻。廣泛討論固定包埋方法后，制備狗脛骨骨折模型，設(shè)3組對照研究，結(jié)果證明

4、70%乙醇固定，epon包埋未脫鈣狗骨組織的BrdU染色效果最好6。Swales和Smith用BrdU單抗在超微水平研究昆蟲血腦屏障，重點探討標記過程對細胞超微結(jié)構(gòu)特征的影響。作者比較4種固定后得出如下結(jié)論：（1）單用多聚甲醛固定可獲得良好的標記效果，但細胞結(jié)構(gòu)易損傷，可加入單節(jié)顯性戊二醛（minomeric glut-aldehyde）聯(lián)合固定；（2）等滲緩沖液加蔗糖磷酸/鹽酸緩血酸胺緩沖劑或PBS對保持細胞結(jié)構(gòu)有較好效果；（3）用脫氧膽酸處理可增加標記，促進抗體聯(lián)接，該項研究清晰顯示線粒體，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)果器10。也有人建議如準備蛋白酶消化時，可用甲醛固定，而不用Carnoy或乙醇。

5、 3、DNA變性 BrdU摻入單鏈DNA堿基序列須經(jīng)酸、堿、酶或加熱等打開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，離子鍵和堿基推積力使DNA雙鏈分離單鏈。DNA變性方式及程度直接影響標記效果，Williamson等回顧123份關(guān)于結(jié)直腸癌的報告，發(fā)現(xiàn)用酸變性約占80%，作者在0.05-3.00MHCL間設(shè)9個濃度比較分析，對每種濃度作用的組織切片分別數(shù)5×103個細胞，結(jié)果冰凍切片0.01M hCL濃度變性后標記指數(shù)最高。低濃度酸產(chǎn)生高LI的原因可能DNA雙鏈失穩(wěn)態(tài)，組胺蛋白離解產(chǎn)生易使抗原摻入的SSSNA片段，另有人提出用低濃度酸從DNA離解出組胺蛋白后加熱變性，可避免組胺產(chǎn)生穩(wěn)定DNA低抗熱變

6、性的作用。消除組胺可降低原位DNA的熔解溫度閾，酸預(yù)處理使染色質(zhì)核小體結(jié)構(gòu)幾乎全部破壞，從而使DNA解螺旋更廣泛11。堅持熱變性者認為加熱較酸對BrdU摻入能提供更多結(jié)合部位。此外，變性和單抗孵育須嚴格銜接，如變性后BU20a單抗孵育延誤1小時，BrdU陽性細胞核標記數(shù)便從6.6%降至1.4%7，說明影響LI的因素復(fù)雜，加單抗前仔細研究變性技術(shù)及干擾因素，從而獲得BrdU標記應(yīng)有的高LI是必要的。另外采作BrdU標記核酸分子可能對DNA變性有特殊要求，需進一步探索。 4、標記染色： 如何延長BrdU作用時間以標記新進入S期的細胞。使增殖緩慢的細胞標記率提高，是另一個重要問題，早年有人用恒定套管

7、裝置和非生物降解彈丸對大鼠研究，但結(jié)果重復(fù)性差。近來Maysinger研制一種具有很好的生物相容性可降解的微囊用于體內(nèi)、外標記，通過電鏡、影像技術(shù)及免疫細胞化學分析，證明微囊中BrdU能有效摻入鼠腦疾患周圍的增生細胞核中，可連續(xù)釋放高濃度BrdU達48-50小時12。另有人研究滲透性微囊和緩彈丸，發(fā)現(xiàn)標記效果均優(yōu)于單次注射。 研究非放射性標記物常與放射性標記物相比，以證明特異性，敏感性及其它有關(guān)特性，在同一靶細胞比較似乎更具有說服力。然而3H-T d R和BrdU的比標記研究不能在同一時間給藥，因兩種標記物在同一個細胞增殖周期內(nèi)競爭胸腺嘧啶激酶。有人認為兩種標記先后給藥均可，另有主張先標Brd

8、U，理由是3H-TdR放射自顯影乳膠用胰酶去除時偶有細胞丟失，致其后BrdU標記信號損失，Lin等強調(diào)BrdU標記時間較3H-TdR長約50分鐘，如先標記3H-TdR可望BrdU能標記更多早期S期細胞3。Thoolen從另外角度觀察兩種標記染色之間關(guān)系，將成年的雄鼠分3組，腹膜下分別注射3H-TdR，BrdU和兩中標記物曲小時后取睪丸標記處理，免疫金銀法染色，分別計數(shù)精原細胞每組平均陽性胞核數(shù)量，結(jié)果3H-TdR標記為162個，BrdU標記為166個，雙標記為146個說明90% BrdU摻入的清原細胞顯示3HTd R標記，另有10%胞核僅顯示一種標記，無交叉性。3H-TdR的射線散射范圍有限，

9、使放射自顯影反應(yīng)不可能超過遠離乳膠1m以上的胞核，這些胞核或許能被BrdU標記顯色，少數(shù)細胞僅接受一種標記的確切原因不清楚，也可能與堿基配對所形成的氫鍵數(shù)量有關(guān)。此外已證明微波，氯化鋰13、氟尿嘧啶核苷等均有助于BrdU標記。 二、檢測： BrdU特異摻入S期細胞，通常測定其LI，即S期細胞占細胞周期的百分數(shù)，標記陽性為光鏡下致密覆蓋于胞核上的褐色沉淀物。檢測方法用單抗或多抗的免疫化學法，也可用DNA熒光染料染色的細胞化學法。目前常用免疫金銀法，因該法不受內(nèi)源性過氧化酶影響，較免疫酶標法有更好對照背景。不同類型細胞DNA對變性敏感性的差別可能由染色質(zhì)結(jié)構(gòu)決定，某些類型對變性反應(yīng)遲鈍，使檢測不敏

10、感或失敗，有人提倡單抗聯(lián)接BrdU后用FCM檢測較免疫組化法更客觀省時，且可測出腫瘤倍體14。但需注意惡性瘤常伴組織及細胞壞死，BrdU不能摻入死亡細胞，故用FCM分析須除外死亡細胞，否則可被錯誤當成靜止細胞。胰酶和Dnase混合孵育細胞標本有可能克服死亡細胞干擾 三、BrdU標記和3H-T d R標記的比較 與32P、35S等常用放射性核素相比，3H-TdR釋放的-粒子能量低，散射極少，因此感光乳膠上的成影分辨最高，放射性損傷相對較小，且半衰期較長。3H-TdR標記用放射自顯影術(shù)和閃爍計數(shù)檢測，靈敏度高，結(jié)果確切。其應(yīng)用價值已經(jīng)肯定。因此研究非放射性標記物多以3H-TdR為標準對照。在腫瘤生

11、物學和細胞增殖動力學的研究中，Mayer在試管內(nèi)分析一組人乳腺癌大樣本，比較BrdU和3H-TdR的標記效果，3H-TdR標記234例，平均LI為6.9±0.4%；BrdU標記450例，平均LI6.4±0.3%，兩種標記物無顯著差異(P0.05)。BrdU和3H-TdR標記的腫瘤大小，組織類型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胞核大小以及DNA倍體均正相關(guān)，充分說明兩種標記物之間的密切關(guān)系。在同一靶細胞標記也證明90%以上標記3H-TdR陽性細胞也標記有BrdU，反之亦然。 四、應(yīng)用： BrdU標記用于DNA修復(fù)、復(fù)制、分子雜交的重組DNA技術(shù)可替代同位素標記，在分子生物學、遺傳學、細胞增殖動

12、力學，腫瘤生物學、免疫學、藥理和藥代動力等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用價值。Kitazaws等用BrdU標記對白血病細胞HL-60和K562基因表達進行研究，將標記DNA和RNA原位雜交，發(fā)現(xiàn)80%用于合成DNA的胸腺嘧啶被BrdU替代15。Stevenson等用BrdU單抗和FCM對哺乳動物細胞BALb/C，3T3，Colon26等6種細胞系研究殺瘤性巨噬細胞的細胞毒作用對細胞動力學的影響。受試細胞系接觸M之前，先經(jīng)BrdU脈沖標記，即在適當時間加入B rdU，只作用短時間馬上洗去，以保證BrdU摻入DNA的精確時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12小時的細胞培養(yǎng)中，6促細胞系的細胞均可被殺瘤性M阻滯在細胞周期的每一個時相

13、內(nèi)16。 近幾年來，由于BrdU標記方法敏感、簡單和迅速，該技術(shù)在腫瘤增殖動力學領(lǐng)域的研究也非?；钴S17-20。目前BrdU標記不僅用于腫瘤診斷，評估預(yù)后，對指導(dǎo)腫瘤治療已受重視，將活檢標本LI作為術(shù)后的是否行輔助治療的依據(jù)，尤其對增大的區(qū)域淋巴結(jié)價值更大，區(qū)域淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移病例可按LI高低確定化療方案，現(xiàn)已明確小劑量化療后腫瘤復(fù)發(fā)者是LI高的病例，而不是LI低者。值得提出的是BrdU的LI較FCM的DI更客觀可靠，因FCM難于識別雙相二倍體和異倍體腫瘤DNA分布的S期細胞，而且DI的S期細胞數(shù)也可能含有死亡細胞21。此外已證明BrdU替代腺嘧啶所合成的DNA對放射性物質(zhì)更敏感，使腫瘤對放療的敏

14、感性增加22，23?？梢灶A(yù)言，BrdU標記作為一種新近倍受重視的材料和方法在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用前景將會十分廣闊。  百事通  參考文獻 Knol JA .Walker SC ,Roberison JM ,et al.Incorporation of 5-bromo-2deoxyuridine into colorectal liver metastases and liver in patients receiving a 7-day hepatic arterial infusion .Cancer Res ,1995,55:3687  Meyer JS .Ko

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