高通量SNP基因分型技術(shù)研究進(jìn)展-

1、10Sheng W et al.J Viro l,2003;77(6:385911Co hen JI,et al.J Viro l,1999;73(9:7627 12Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7:1843 13Gao Y et al.Oncogene,2002;21(5:82514Tanner JE et al.J Infect Dis,1997;175(1:3815Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19:5584 16Brink AA et al.J Clin Micro biol,1998;36(11:3164

2、17Hayes DP et al.Mol Patho l,1999;52(2:9718zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10:2745(2002211201收稿高通量SNP基因分型技術(shù)研究進(jìn)展方唯意綜述姚開泰審閱中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所(長沙,410078摘要在后基因組時(shí)代,單核苷酸多態(tài)性研究已迅速成為了生物醫(yī)學(xué)許多領(lǐng)域的焦點(diǎn)。發(fā)展可靠、敏感、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、高通量的S NP基因分型技術(shù)已迫在眉睫。本文主要著重于高通量SN P基因分型技術(shù)的原理、利弊以及這些技術(shù)在這個(gè)領(lǐng)域過去幾年中的進(jìn)展。關(guān)鍵詞高通量;單核苷酸多態(tài)性;基因分型單核苷酸多態(tài)性(S NPs

3、是最普遍的遺傳變異形式。通過開展具有明顯表型特征的S NPs基因分型大規(guī)模相關(guān)研究,有助于鑒定許多復(fù)雜疾病原因,了解個(gè)體對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應(yīng)。人類基因組測序的完成和142萬個(gè)S NPs在基因組上的定位1,為首次在全基因組水平上進(jìn)行S NPs研究打開了方便大門。經(jīng)典的S NPs分析方法是PCR 擴(kuò)增后用凝膠電泳檢測,雖然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微陣列和其他高通量篩選技術(shù)效率有了明顯的提高,但臨床應(yīng)用絕非可靠,因此,有必要改進(jìn)和發(fā)展新的可靠、敏感、高通量、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的SNPs基因分型技術(shù)。在本文中,我們主要闡述高通量SN Ps基因分型方法,包括一步均質(zhì)法、焦磷酸測序、D N

4、A芯片/陣列分析法、微球法、M A LDI2TO F質(zhì)譜基因分型分析法等,討論這些技術(shù)的目前狀態(tài)和將來潛力。1一步均質(zhì)法Taqman、Sc orpion分析和分子燈塔組成了微滴定平板熒光閱讀系統(tǒng)。Taqman和分子燈塔都依賴于等位基因特異性寡核苷酸雜交在PCR期間對等位基因進(jìn)行區(qū)分。而Scorpion分析能使用等位基因特異性PCR或是等位基因特異性雜交反應(yīng)2來區(qū)分等位基因。它們作為一個(gè)末端分析能在一個(gè)完全均質(zhì)的反應(yīng)條件下進(jìn)行分析。在反應(yīng)起始,所有試劑和基因組D NA都混合在一起,經(jīng)熱循環(huán)步驟后,熒光信號(hào)能被檢測到。該反應(yīng)既沒有單獨(dú)的預(yù)擴(kuò)增步驟,也沒有中間的處理過程,因此它們是一種最簡單的分析方

5、法。由于沒有適合這些方法的384孔熒光檢測器,以及熒光標(biāo)記探針的價(jià)格過高和缺乏可靠的自動(dòng)化基因型呼叫軟件,因此阻礙了這些方法的發(fā)展。最近,Applied Biosystems公司新開發(fā)的7900HT型高通量熒光定量PCR儀,使得進(jìn)行384孔微滴定平板熒光檢測成為了可能,這主要?dú)w因于高通量能力的增加和反應(yīng)容積的減少。當(dāng)如果要發(fā)展更高的基因分型通量時(shí),一個(gè)可靠的自動(dòng)化等位基因呼叫能力是必須的,它不只是糾正基因型呼叫信號(hào)更快,而且在處理和加工數(shù)據(jù)上必須更迅速,更準(zhǔn)確。近來研究表明,自動(dòng)化基因型呼叫在無陽性對照情況下進(jìn)行聚類分析是可行的3。2焦磷酸測序Pyrosequencing焦磷酸測序是對短到中等

6、長度的D NA序列樣品進(jìn)行高通量、精確和重復(fù)性好的分析方法。其反應(yīng)原理是當(dāng)測序引物與PCR擴(kuò)增的,單鏈D NA模板雜交,和各種酶包括D NA聚合酶、A TP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、以及底物、熒光素一起共同孵育。4種dN TP之一被加入反應(yīng)體系,如與模板配對,該dNT P與引物的末端形成共價(jià)鍵,dN TP 的焦磷酸基團(tuán)釋放出來。A TP硫酸化酶在APS存在的情況下催化焦磷酸生成A TP,ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化,氧化熒光素發(fā)出的可見光信號(hào)與ATP量成正比。A TP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解,光信號(hào)淬滅,并再生反應(yīng)體系,然后再加另一種dN T

7、P繼續(xù)反應(yīng)。焦磷酸測序最初作為D N A測序方法而發(fā)展起來的,其化學(xué)反應(yīng)與Sanger雙脫氧二核苷酸法完全不同。它無需灌膠、毛細(xì)管電泳,也無需同位素或熒光染料的一種測序技術(shù)。由于該法閱讀側(cè)翼序列和S NP 位點(diǎn)本身,以及其高度特異性(非特異性結(jié)合不產(chǎn)生假陽性信號(hào)使得焦磷酸測序成為一種具有吸引力和準(zhǔn)確的S NP基因分型方法。焦磷酸測序除了提供高準(zhǔn)確性、靈活性以及并行處理過程外,焦磷酸測序很容易實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化的基因分型。目前,Pyrose2 quencing AB公司已開發(fā)了適合于96孔中通量和384孔全自動(dòng)化高通量的儀器,后者有能力每天進(jìn)行數(shù)萬個(gè)基因分型。焦磷酸測序與一些標(biāo)準(zhǔn)基因分型方法相比,還有

8、一些不利方面,即PCR反應(yīng)時(shí)生物素標(biāo)記引物價(jià)格較高,以及這種分析需要特殊儀器。目前新研發(fā)了幾種技術(shù),旨在減少焦磷酸測序前的費(fèi)用,主要是在模板制備方面,包括標(biāo)準(zhǔn)固相模板制備、三引物的固相模板制備和酶解模板制備4。Pyrosequencing AB公司發(fā)展、制造和銷售研究產(chǎn)品,這使得生命科學(xué)研究者能更有效地得到大規(guī)?；蚪M信息5。3DNA芯片/陣列分析當(dāng)D NA芯片的技術(shù)開始出現(xiàn)時(shí),它通過使用一個(gè)簡單的等位基因特異性雜交檢測技術(shù)為高度并行基因分型帶來了巨大的希望。然而到目前為此,以等位基因特異性雜交為基礎(chǔ)的D N A芯片使用數(shù)量受到了一定的限制,主要是因?yàn)榈任换蛱禺愋噪s交很難獲得良好的信噪比。在

9、雜交反應(yīng)中,完全匹配和非完全匹配的寡核苷酸區(qū)分的特異性受到了一定的限制,與D NA聚合酶或連接酶參與的區(qū)分反應(yīng)相比,其特異性更低。當(dāng)許多不同的寡核苷酸如在同一條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí),這種特異性問題將變得更加突出。盡管過去幾年里想了很多的方法,其中包括高冗余芯片技術(shù),但解決特異性這個(gè)問題一直并非易事。由美國Aff ymetrix公司研發(fā)的寡核苷酸SNP芯片就是利用寡核苷酸與DN A完全和不完全互補(bǔ)所造成的這種雜交在熱穩(wěn)定性上的差異來分析SNP。近年來在Nature和Science發(fā)表的一些文章,就采用了這一芯片。但這種芯片最大的缺點(diǎn)就是可靠性較差,對S NP位點(diǎn)較少分析時(shí),該芯片可使誤差小于1%,

10、位點(diǎn)較多時(shí),僅假陽性便可高達(dá)40%,這樣的誤差在臨床應(yīng)用時(shí)是絕對不允許的6。鑒于目前S NP芯片研究狀況和理論上對SN P芯片的需求,Z hang和Li7開發(fā)了一種新的技術(shù),即3c末端標(biāo)記引物延伸法。它主要是利用聚合酶式反應(yīng)原理,應(yīng)用堿基特異性引物3c末端標(biāo)記PC R的設(shè)計(jì)方案研發(fā)了一種進(jìn)行SNP分析的芯片,這一技術(shù)的原理是將不配對的堿基置于3c末端或次3c末端。這一設(shè)計(jì)的巧妙之處在于標(biāo)記物或者說可檢測信號(hào),永遠(yuǎn)只會(huì)來源于完全配對的引物。單堿基延伸與固相結(jié)合的寡核苷酸聯(lián)合現(xiàn)已成功運(yùn)用于微陣列SNP并行分析8。該方法與等位基因特異性雜交平臺(tái)相比,由于D NA聚合酶在結(jié)合互補(bǔ)反應(yīng)中高保真性作用,其

11、特異性信號(hào)更強(qiáng)。這種方法的一個(gè)變化是在引物3c末端結(jié)合變異等位基因去檢測等位基因特異性延伸?；驑?biāo)記分型法不斷的發(fā)展,并能克服固相反應(yīng)中對它的一些限制。在這個(gè)系統(tǒng)中,一個(gè)高度多重單堿基延伸反應(yīng)使用5c端標(biāo)記序列、熒光標(biāo)記的雙脫氧二核苷酸的引物在溶液中進(jìn)行。引物中的標(biāo)記序列本身并沒有參與單堿基延伸反應(yīng),而是隨后參與了與D N A芯片中的寡核苷酸結(jié)合。以固相單堿基延伸為基礎(chǔ)的標(biāo)記陣列分析方法有如下優(yōu)點(diǎn):¹由于價(jià)格的降低和它在不同S NP基因分型分析中使用相同D N A芯片的能力,普通D NA芯片也能夠使用。º在溶液中可進(jìn)行酶學(xué)反應(yīng)。»因在寡核苷酸末端沒有3c O H殘

12、基的存在,故在D NA芯片中應(yīng)用時(shí)很少受到限制?？傊?標(biāo)記陣列和單堿基延伸或基于連接酶解反應(yīng)的聯(lián)合運(yùn)用提供了超高通量分析潛力的基因分型平臺(tái)。一些公司如Aff metrix等一直致力于開發(fā)標(biāo)記陣列基因分型系統(tǒng)。4微球(Bead-Based法這種分析方法是非常類似于D N A芯片分析方法,其區(qū)別在于微球法寡核苷酸粘附于直徑35 L m的微球體上,而不同于D NA芯片,固定在表面。微球法能與用于D N A芯片標(biāo)記陣列的大部分等位基因區(qū)分反應(yīng)相結(jié)合,如單堿基延伸反應(yīng)和寡核苷酸連接反應(yīng)。它在多重性和S NP聯(lián)合上有著巨大的靈活性。在微球法分析中,每一個(gè)微球體的身份都需要被確定,而且,這種信息將與來自于微

13、球體的基因型信號(hào)相結(jié)合后指派一個(gè)基因呼叫信號(hào)到一個(gè)S NP中去。因此,有必要對每個(gè)微球體進(jìn)行分子鑒定和分類。一個(gè)使用熒光編碼的微球體基因分型平臺(tái)已由L uminex公司開發(fā)出來。這些微球體由兩種不同的染料(紅色和綠色所包被,能基于微球體表面上兩種染料的量多少,能通過流式細(xì)胞儀鑒定和分離。如果有100不同信號(hào)比(紅色/桔黃色類型的微球體,那么有可能在一個(gè)反應(yīng)管中做100次檢測。反應(yīng)后,這些微球體被熒光檢測器區(qū)分,而且,每一組的微球體的基因分型信號(hào)都受到單獨(dú)的檢測。實(shí)質(zhì)上,每一根反應(yīng)管相當(dāng)于D N A芯片上的100個(gè)位點(diǎn)?，F(xiàn)在,由于96孔流式熒光檢測器的出現(xiàn),在技術(shù)上有可能于96孔格式反應(yīng)中對數(shù)千

14、個(gè)基因型進(jìn)行記分。這種以微球體平臺(tái)為基礎(chǔ)的技術(shù)已經(jīng)開始與寡核苷酸連接反應(yīng)9、等位基因特異性雜交10、單堿基延伸法11和等位基因特異性引物延伸12聯(lián)合應(yīng)用。盡管這種分析系統(tǒng)已經(jīng)獲得了合理高通量,但是,仍有一些因素限制了該系統(tǒng)向更高通量發(fā)展。目前用于微球體檢測的染料數(shù)目聯(lián)合被設(shè)定在1002plex。另外的限制因素是能夠使用于基因分型信號(hào)染料的數(shù)量。由Illumina公司開發(fā)的多種商業(yè)化柱子平臺(tái),它是由光學(xué)纖維制造出來的,微球體在固體孔中被捕獲13。每一個(gè)孔只適合一個(gè)微球體。當(dāng)微球體固定在這些孔中,這個(gè)系統(tǒng)便可作為一張高密度微陣列來對待。在某種意義上說,Illumina微球體系統(tǒng)更象D N A芯片平

15、臺(tái)。使用這種方法,50000個(gè)微球體能裝配成一張微陣列片上。這些特征使得光學(xué)纖維微球體陣列系統(tǒng)有一個(gè)非常高的多重性潛力。5質(zhì)譜基因分型分析這種方法的原理是使用質(zhì)譜直接或間接檢測等位基因特異性延伸區(qū)分反應(yīng)產(chǎn)物14。各種等位基因區(qū)分反應(yīng)如單堿基延伸及其變化形式15、等位基因特異性肽核酸(PNA、Invader、堿基特異性裂解16和等位基因特異性PCR已成功的和質(zhì)譜檢測法聯(lián)合應(yīng)用。單堿基延伸或其修飾形式與基質(zhì)輔助激光吸收/離子飛行時(shí)間(M A LDI2T OF質(zhì)譜結(jié)合已被廣泛的應(yīng)用,并已被一些公司(Sequenom發(fā)展為商業(yè)性產(chǎn)品。M ALD I2TOF質(zhì)譜檢測的優(yōu)點(diǎn)在于其速度和多重性能力。例如一個(gè)

16、中等質(zhì)譜檢測器1d能記錄4萬個(gè)光譜,理論上52plex檢測格式能對20萬基因型進(jìn)行記分。然而,它們的限速步驟不是質(zhì)譜儀的檢測過程,而是酶學(xué)反應(yīng)之前和反應(yīng)后樣品處理過程。在大部分質(zhì)譜分析方法中,52plex反應(yīng)或許是為獲得多重性可靠信號(hào)現(xiàn)實(shí)的制約,部分是由于檢測質(zhì)譜的范圍以及質(zhì)譜區(qū)分的敏感性所致。反應(yīng)后樣品處理過程比其它基因分型格式更復(fù)雜,因?yàn)橘|(zhì)譜檢測儀對分析樣品的純度要求非常高。Se2 quenom的M assArray自動(dòng)化系統(tǒng)是利用離子交換樹脂于對樣品進(jìn)行固相純化,而Applied Biosystems是通過微型逆相液化層析進(jìn)行樣品純化的。另一個(gè)分析系統(tǒng)即/GO OD分析系統(tǒng)170在反應(yīng)中

17、涉及到使用化學(xué)修飾引物,然后酶解去掉未延伸的引物以及修飾產(chǎn)物烷化,這樣使得用于質(zhì)譜檢測的樣品制備簡單、經(jīng)濟(jì)和有效。另外,烷化產(chǎn)物也能增加質(zhì)譜檢測分析的敏感性。由于質(zhì)譜分析內(nèi)在本質(zhì)使得基因分型準(zhǔn)確性非常高是它又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)譜分析的敏感性、每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物的高特異性以及對一些類型的反應(yīng)來說,每個(gè)反應(yīng)都有內(nèi)部的校正標(biāo)準(zhǔn),所有這些都?xì)w因于質(zhì)譜分析的準(zhǔn)確性。特別是當(dāng)直接檢測等位基因區(qū)分產(chǎn)物時(shí),質(zhì)譜分析法背景很少,允許精確的自動(dòng)化基因呼叫。在當(dāng)今所有商業(yè)化可得到的基因分型系統(tǒng)中,質(zhì)譜基因分型分析通量是最高的,它是將來在整個(gè)基因組相關(guān)研究中超高通量基因分型的主要競爭者。6溫控高效液相色譜法TmHPLC1995年

18、,Oefner等用溫控高效液相色譜法(TmHPLC即(D HPLC篩選D N A序列多態(tài)性。TmH2 PL C用于基因突變篩檢的主要工作原理是通過離子反相HPL C檢測不完全匹配的雜合雙螺旋PCR產(chǎn)物。發(fā)生突變的基因片段在變性溫度下與野生型片段發(fā)生不完全配對,從而形成完全配對的野生型、完全配對的突變型和不完全配對的雜合型PCR擴(kuò)增片段。在部分變性溫度(Tm下,通過一定的梯度洗脫使不同類型的片段在分離柱中得到分離。出現(xiàn)突變的PCR片段用紫外檢測器檢測時(shí)出現(xiàn)多峰型信號(hào),而野生型表現(xiàn)為單峰型。目前,T mHPL C技術(shù)發(fā)展包括改善檢測信號(hào)強(qiáng)度與質(zhì)量、選擇更好的分離介質(zhì)以及提高預(yù)測突變性質(zhì)的能力。隨著

19、分離柱專利技術(shù)儀器和方法不斷改進(jìn),Tm HPL C形成了獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢?？傊?Tm HPL C通過比較異源雙鏈與同源雙鏈,可以敏感而準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)D N A變異,只是新發(fā)現(xiàn)的變異需進(jìn)一步測序鑒定。但它能明顯減少測序工作量,尤其對鑒別稀少的變異型,可明顯降低成本,并加快獲取數(shù)據(jù)的速度。另外,它還具有快速、檢出率高(可達(dá)95%100%、適合大片段、PCR 產(chǎn)物無需純化,自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)。Huang等18等利用Tm HPL C在6p21.3進(jìn)行鼻咽癌相關(guān)基因SNP 篩選,結(jié)果在5個(gè)片段中,鑒定了4個(gè)新的SN P,另外也證實(shí)了4個(gè)已知SN P位點(diǎn)和基因型。目前,該技術(shù)在基因突變分析、單核苷酸多態(tài)性篩選等許

20、多領(lǐng)域里得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)是一種很有前途的高通量基因分型技術(shù)。7小結(jié)和展望今天,至少約有20種不同的S NP基因分型方法,其中包含了各種不同的等位基因區(qū)分反應(yīng)和信號(hào)檢測方法的聯(lián)合。它們中的許多已經(jīng)發(fā)展為384孔板格式和自動(dòng)化商業(yè)產(chǎn)品?；谫|(zhì)譜分析法、標(biāo)記陣列分析法和一步均質(zhì)法在高通量基因分型中都有其顯著的優(yōu)點(diǎn),它們將是前沿領(lǐng)跑者以帶動(dòng)整個(gè)基因組相關(guān)研究。一些其它方法如焦磷酸測序等也快速發(fā)展以獲得更高通量基因分型。然而,由于與質(zhì)譜分析方法、標(biāo)記陣列分析法相比較缺乏高度多重性,以及與一步均質(zhì)法相比缺少額外處理步驟潛力,因此,對于這些分析方法而言要獲得更高通量仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。另外,還有一些其它新

21、出現(xiàn)的方法,如動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交,這種分析是在全自動(dòng)化的微滴定板中,通過便利的熒光信號(hào)檢測進(jìn)行的。該法簡單,經(jīng)濟(jì),但它還必須進(jìn)一步發(fā)展裝備去參與競爭性高通量平臺(tái)。人類基因組計(jì)劃的實(shí)施,產(chǎn)生了大量的S NP,生物信息學(xué)資源爆炸性的積累,隨之推動(dòng)了S NP基因分型新技術(shù)的發(fā)展。由于高通量基因分型技術(shù)的發(fā)展,這就使得我們進(jìn)行大規(guī)模的基因組相關(guān)研究以及藥物遺傳學(xué)研究成為可能,并將使得現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的診斷和治療發(fā)生革命性的變化。在不久的將來,臨床醫(yī)師能根據(jù)病人的遺傳圖譜,具體的給每一位患者作出正確的診斷,最終給予病人最有效和最方便的藥物。參考文獻(xiàn)1Sachidanandam R et al.Nature,

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