高通量SNP基因分型技術研究進展-

1、10Sheng W et al.J Viro l,2003;77(6:385911Co hen JI,et al.J Viro l,1999;73(9:7627 12Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7:1843 13Gao Y et al.Oncogene,2002;21(5:82514Tanner JE et al.J Infect Dis,1997;175(1:3815Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19:5584 16Brink AA et al.J Clin Micro biol,1998;36(11:3164

2、17Hayes DP et al.Mol Patho l,1999;52(2:9718zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10:2745(2002211201收稿高通量SNP基因分型技術研究進展方唯意綜述姚開泰審閱中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所(長沙,410078摘要在后基因組時代,單核苷酸多態(tài)性研究已迅速成為了生物醫(yī)學許多領域的焦點。發(fā)展可靠、敏感、經濟、穩(wěn)定、高通量的S NP基因分型技術已迫在眉睫。本文主要著重于高通量SN P基因分型技術的原理、利弊以及這些技術在這個領域過去幾年中的進展。關鍵詞高通量;單核苷酸多態(tài)性;基因分型單核苷酸多態(tài)性(S NPs

3、是最普遍的遺傳變異形式。通過開展具有明顯表型特征的S NPs基因分型大規(guī)模相關研究,有助于鑒定許多復雜疾病原因,了解個體對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應。人類基因組測序的完成和142萬個S NPs在基因組上的定位1,為首次在全基因組水平上進行S NPs研究打開了方便大門。經典的S NPs分析方法是PCR 擴增后用凝膠電泳檢測,雖然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微陣列和其他高通量篩選技術效率有了明顯的提高,但臨床應用絕非可靠,因此,有必要改進和發(fā)展新的可靠、敏感、高通量、經濟、穩(wěn)定的SNPs基因分型技術。在本文中,我們主要闡述高通量SN Ps基因分型方法,包括一步均質法、焦磷酸測序、D N

4、A芯片/陣列分析法、微球法、M A LDI2TO F質譜基因分型分析法等,討論這些技術的目前狀態(tài)和將來潛力。1一步均質法Taqman、Sc orpion分析和分子燈塔組成了微滴定平板熒光閱讀系統(tǒng)。Taqman和分子燈塔都依賴于等位基因特異性寡核苷酸雜交在PCR期間對等位基因進行區(qū)分。而Scorpion分析能使用等位基因特異性PCR或是等位基因特異性雜交反應2來區(qū)分等位基因。它們作為一個末端分析能在一個完全均質的反應條件下進行分析。在反應起始,所有試劑和基因組D NA都混合在一起,經熱循環(huán)步驟后,熒光信號能被檢測到。該反應既沒有單獨的預擴增步驟,也沒有中間的處理過程,因此它們是一種最簡單的分析方

5、法。由于沒有適合這些方法的384孔熒光檢測器,以及熒光標記探針的價格過高和缺乏可靠的自動化基因型呼叫軟件,因此阻礙了這些方法的發(fā)展。最近,Applied Biosystems公司新開發(fā)的7900HT型高通量熒光定量PCR儀,使得進行384孔微滴定平板熒光檢測成為了可能,這主要歸因于高通量能力的增加和反應容積的減少。當如果要發(fā)展更高的基因分型通量時,一個可靠的自動化等位基因呼叫能力是必須的,它不只是糾正基因型呼叫信號更快,而且在處理和加工數(shù)據上必須更迅速,更準確。近來研究表明,自動化基因型呼叫在無陽性對照情況下進行聚類分析是可行的3。2焦磷酸測序Pyrosequencing焦磷酸測序是對短到中等

6、長度的D NA序列樣品進行高通量、精確和重復性好的分析方法。其反應原理是當測序引物與PCR擴增的,單鏈D NA模板雜交,和各種酶包括D NA聚合酶、A TP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、以及底物、熒光素一起共同孵育。4種dN TP之一被加入反應體系,如與模板配對,該dNT P與引物的末端形成共價鍵,dN TP 的焦磷酸基團釋放出來。A TP硫酸化酶在APS存在的情況下催化焦磷酸生成A TP,ATP驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉化,氧化熒光素發(fā)出的可見光信號與ATP量成正比。A TP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解,光信號淬滅,并再生反應體系,然后再加另一種dN T

7、P繼續(xù)反應。焦磷酸測序最初作為D N A測序方法而發(fā)展起來的,其化學反應與Sanger雙脫氧二核苷酸法完全不同。它無需灌膠、毛細管電泳,也無需同位素或熒光染料的一種測序技術。由于該法閱讀側翼序列和S NP 位點本身,以及其高度特異性(非特異性結合不產生假陽性信號使得焦磷酸測序成為一種具有吸引力和準確的S NP基因分型方法。焦磷酸測序除了提供高準確性、靈活性以及并行處理過程外,焦磷酸測序很容易實現(xiàn)全自動化的基因分型。目前,Pyrose2 quencing AB公司已開發(fā)了適合于96孔中通量和384孔全自動化高通量的儀器,后者有能力每天進行數(shù)萬個基因分型。焦磷酸測序與一些標準基因分型方法相比,還有

8、一些不利方面,即PCR反應時生物素標記引物價格較高,以及這種分析需要特殊儀器。目前新研發(fā)了幾種技術,旨在減少焦磷酸測序前的費用,主要是在模板制備方面,包括標準固相模板制備、三引物的固相模板制備和酶解模板制備4。Pyrosequencing AB公司發(fā)展、制造和銷售研究產品,這使得生命科學研究者能更有效地得到大規(guī)?；蚪M信息5。3DNA芯片/陣列分析當D NA芯片的技術開始出現(xiàn)時,它通過使用一個簡單的等位基因特異性雜交檢測技術為高度并行基因分型帶來了巨大的希望。然而到目前為此,以等位基因特異性雜交為基礎的D N A芯片使用數(shù)量受到了一定的限制,主要是因為等位基因特異性雜交很難獲得良好的信噪比。在

9、雜交反應中,完全匹配和非完全匹配的寡核苷酸區(qū)分的特異性受到了一定的限制,與D NA聚合酶或連接酶參與的區(qū)分反應相比,其特異性更低。當許多不同的寡核苷酸如在同一條件下進行雜交反應時,這種特異性問題將變得更加突出。盡管過去幾年里想了很多的方法,其中包括高冗余芯片技術,但解決特異性這個問題一直并非易事。由美國Aff ymetrix公司研發(fā)的寡核苷酸SNP芯片就是利用寡核苷酸與DN A完全和不完全互補所造成的這種雜交在熱穩(wěn)定性上的差異來分析SNP。近年來在Nature和Science發(fā)表的一些文章,就采用了這一芯片。但這種芯片最大的缺點就是可靠性較差,對S NP位點較少分析時,該芯片可使誤差小于1%,

10、位點較多時,僅假陽性便可高達40%,這樣的誤差在臨床應用時是絕對不允許的6。鑒于目前S NP芯片研究狀況和理論上對SN P芯片的需求,Z hang和Li7開發(fā)了一種新的技術,即3c末端標記引物延伸法。它主要是利用聚合酶式反應原理,應用堿基特異性引物3c末端標記PC R的設計方案研發(fā)了一種進行SNP分析的芯片,這一技術的原理是將不配對的堿基置于3c末端或次3c末端。這一設計的巧妙之處在于標記物或者說可檢測信號,永遠只會來源于完全配對的引物。單堿基延伸與固相結合的寡核苷酸聯(lián)合現(xiàn)已成功運用于微陣列SNP并行分析8。該方法與等位基因特異性雜交平臺相比,由于D NA聚合酶在結合互補反應中高保真性作用,其

11、特異性信號更強。這種方法的一個變化是在引物3c末端結合變異等位基因去檢測等位基因特異性延伸?；驑擞浄中头ú粩嗟陌l(fā)展,并能克服固相反應中對它的一些限制。在這個系統(tǒng)中,一個高度多重單堿基延伸反應使用5c端標記序列、熒光標記的雙脫氧二核苷酸的引物在溶液中進行。引物中的標記序列本身并沒有參與單堿基延伸反應,而是隨后參與了與D N A芯片中的寡核苷酸結合。以固相單堿基延伸為基礎的標記陣列分析方法有如下優(yōu)點:¹由于價格的降低和它在不同S NP基因分型分析中使用相同D N A芯片的能力,普通D NA芯片也能夠使用。º在溶液中可進行酶學反應。»因在寡核苷酸末端沒有3c O H殘

12、基的存在,故在D NA芯片中應用時很少受到限制?？傊?標記陣列和單堿基延伸或基于連接酶解反應的聯(lián)合運用提供了超高通量分析潛力的基因分型平臺。一些公司如Aff metrix等一直致力于開發(fā)標記陣列基因分型系統(tǒng)。4微球(Bead-Based法這種分析方法是非常類似于D N A芯片分析方法,其區(qū)別在于微球法寡核苷酸粘附于直徑35 L m的微球體上,而不同于D NA芯片,固定在表面。微球法能與用于D N A芯片標記陣列的大部分等位基因區(qū)分反應相結合,如單堿基延伸反應和寡核苷酸連接反應。它在多重性和S NP聯(lián)合上有著巨大的靈活性。在微球法分析中,每一個微球體的身份都需要被確定,而且,這種信息將與來自于微

13、球體的基因型信號相結合后指派一個基因呼叫信號到一個S NP中去。因此,有必要對每個微球體進行分子鑒定和分類。一個使用熒光編碼的微球體基因分型平臺已由L uminex公司開發(fā)出來。這些微球體由兩種不同的染料(紅色和綠色所包被,能基于微球體表面上兩種染料的量多少,能通過流式細胞儀鑒定和分離。如果有100不同信號比(紅色/桔黃色類型的微球體,那么有可能在一個反應管中做100次檢測。反應后,這些微球體被熒光檢測器區(qū)分,而且,每一組的微球體的基因分型信號都受到單獨的檢測。實質上,每一根反應管相當于D N A芯片上的100個位點?，F(xiàn)在,由于96孔流式熒光檢測器的出現(xiàn),在技術上有可能于96孔格式反應中對數(shù)千

14、個基因型進行記分。這種以微球體平臺為基礎的技術已經開始與寡核苷酸連接反應9、等位基因特異性雜交10、單堿基延伸法11和等位基因特異性引物延伸12聯(lián)合應用。盡管這種分析系統(tǒng)已經獲得了合理高通量,但是,仍有一些因素限制了該系統(tǒng)向更高通量發(fā)展。目前用于微球體檢測的染料數(shù)目聯(lián)合被設定在1002plex。另外的限制因素是能夠使用于基因分型信號染料的數(shù)量。由Illumina公司開發(fā)的多種商業(yè)化柱子平臺,它是由光學纖維制造出來的,微球體在固體孔中被捕獲13。每一個孔只適合一個微球體。當微球體固定在這些孔中,這個系統(tǒng)便可作為一張高密度微陣列來對待。在某種意義上說,Illumina微球體系統(tǒng)更象D N A芯片平

15、臺。使用這種方法,50000個微球體能裝配成一張微陣列片上。這些特征使得光學纖維微球體陣列系統(tǒng)有一個非常高的多重性潛力。5質譜基因分型分析這種方法的原理是使用質譜直接或間接檢測等位基因特異性延伸區(qū)分反應產物14。各種等位基因區(qū)分反應如單堿基延伸及其變化形式15、等位基因特異性肽核酸(PNA、Invader、堿基特異性裂解16和等位基因特異性PCR已成功的和質譜檢測法聯(lián)合應用。單堿基延伸或其修飾形式與基質輔助激光吸收/離子飛行時間(M A LDI2T OF質譜結合已被廣泛的應用,并已被一些公司(Sequenom發(fā)展為商業(yè)性產品。M ALD I2TOF質譜檢測的優(yōu)點在于其速度和多重性能力。例如一個

16、中等質譜檢測器1d能記錄4萬個光譜,理論上52plex檢測格式能對20萬基因型進行記分。然而,它們的限速步驟不是質譜儀的檢測過程,而是酶學反應之前和反應后樣品處理過程。在大部分質譜分析方法中,52plex反應或許是為獲得多重性可靠信號現(xiàn)實的制約,部分是由于檢測質譜的范圍以及質譜區(qū)分的敏感性所致。反應后樣品處理過程比其它基因分型格式更復雜,因為質譜檢測儀對分析樣品的純度要求非常高。Se2 quenom的M assArray自動化系統(tǒng)是利用離子交換樹脂于對樣品進行固相純化,而Applied Biosystems是通過微型逆相液化層析進行樣品純化的。另一個分析系統(tǒng)即/GO OD分析系統(tǒng)170在反應中

17、涉及到使用化學修飾引物,然后酶解去掉未延伸的引物以及修飾產物烷化,這樣使得用于質譜檢測的樣品制備簡單、經濟和有效。另外,烷化產物也能增加質譜檢測分析的敏感性。由于質譜分析內在本質使得基因分型準確性非常高是它又一個優(yōu)點。質譜分析的敏感性、每個反應產物的高特異性以及對一些類型的反應來說,每個反應都有內部的校正標準,所有這些都歸因于質譜分析的準確性。特別是當直接檢測等位基因區(qū)分產物時,質譜分析法背景很少,允許精確的自動化基因呼叫。在當今所有商業(yè)化可得到的基因分型系統(tǒng)中,質譜基因分型分析通量是最高的,它是將來在整個基因組相關研究中超高通量基因分型的主要競爭者。6溫控高效液相色譜法TmHPLC1995年

18、,Oefner等用溫控高效液相色譜法(TmHPLC即(D HPLC篩選D N A序列多態(tài)性。TmH2 PL C用于基因突變篩檢的主要工作原理是通過離子反相HPL C檢測不完全匹配的雜合雙螺旋PCR產物。發(fā)生突變的基因片段在變性溫度下與野生型片段發(fā)生不完全配對,從而形成完全配對的野生型、完全配對的突變型和不完全配對的雜合型PCR擴增片段。在部分變性溫度(Tm下,通過一定的梯度洗脫使不同類型的片段在分離柱中得到分離。出現(xiàn)突變的PCR片段用紫外檢測器檢測時出現(xiàn)多峰型信號,而野生型表現(xiàn)為單峰型。目前,T mHPL C技術發(fā)展包括改善檢測信號強度與質量、選擇更好的分離介質以及提高預測突變性質的能力。隨著

19、分離柱專利技術儀器和方法不斷改進,Tm HPL C形成了獨特的技術優(yōu)勢?？傊?Tm HPL C通過比較異源雙鏈與同源雙鏈,可以敏感而準確地發(fā)現(xiàn)D N A變異,只是新發(fā)現(xiàn)的變異需進一步測序鑒定。但它能明顯減少測序工作量,尤其對鑒別稀少的變異型,可明顯降低成本,并加快獲取數(shù)據的速度。另外,它還具有快速、檢出率高(可達95%100%、適合大片段、PCR 產物無需純化,自動化操作等優(yōu)點。Huang等18等利用Tm HPL C在6p21.3進行鼻咽癌相關基因SNP 篩選,結果在5個片段中,鑒定了4個新的SN P,另外也證實了4個已知SN P位點和基因型。目前,該技術在基因突變分析、單核苷酸多態(tài)性篩選等許

20、多領域里得到了廣泛的應用。該技術是一種很有前途的高通量基因分型技術。7小結和展望今天,至少約有20種不同的S NP基因分型方法,其中包含了各種不同的等位基因區(qū)分反應和信號檢測方法的聯(lián)合。它們中的許多已經發(fā)展為384孔板格式和自動化商業(yè)產品?；谫|譜分析法、標記陣列分析法和一步均質法在高通量基因分型中都有其顯著的優(yōu)點,它們將是前沿領跑者以帶動整個基因組相關研究。一些其它方法如焦磷酸測序等也快速發(fā)展以獲得更高通量基因分型。然而,由于與質譜分析方法、標記陣列分析法相比較缺乏高度多重性,以及與一步均質法相比缺少額外處理步驟潛力,因此,對于這些分析方法而言要獲得更高通量仍是一個挑戰(zhàn)。另外,還有一些其它新

21、出現(xiàn)的方法,如動態(tài)等位基因特異性雜交,這種分析是在全自動化的微滴定板中,通過便利的熒光信號檢測進行的。該法簡單,經濟,但它還必須進一步發(fā)展裝備去參與競爭性高通量平臺。人類基因組計劃的實施,產生了大量的S NP,生物信息學資源爆炸性的積累,隨之推動了S NP基因分型新技術的發(fā)展。由于高通量基因分型技術的發(fā)展,這就使得我們進行大規(guī)模的基因組相關研究以及藥物遺傳學研究成為可能,并將使得現(xiàn)代醫(yī)學的診斷和治療發(fā)生革命性的變化。在不久的將來,臨床醫(yī)師能根據病人的遺傳圖譜,具體的給每一位患者作出正確的診斷,最終給予病人最有效和最方便的藥物。參考文獻1Sachidanandam R et al.Nature,

22、2001;409(6822:9282Thel well N et al.N ucleic Acids Res,2000;28(19:37523Ranade K et al.Genome Res,2001;11(7:12624Fakhrai2Rad H et al.Hum Mutat,2002;19(5:4795McNeely T.Pharmaco geno mics,2003;4(2:2176Cu tler D J et al.Geno me Res,2001;11(11:19137Zhang J,Li K.Curr Drug Disco very,2001;9,218Lindroo s K

23、et al.Nucleic Acids Res,2001;29(13:E699Iannone MA et al.Cy to metry,2000;39(2:13110Armstrong B et al.Cytometry,2000;40(2:10211Chen J et al.Geno me Res,2000;10(4:54912Ye F et al.Hum Mutat.2001;17(4:30513Steemers FJ et al.Nat Biotechno l.2000;18(1:9114Yang H et al.Anal Biochem,2003;314(1:5415Sauer S et al.N ucleic Acids Res,2000;28(5:E1316Bocker S.Bioinformatics,2003;19Suppl1:I4417Sauer S,G ut IG.Rapid Co mmun Mass Spectrom,2003;17(12:1