微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的應(yīng)用研究進(jìn)展

1、微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的應(yīng)用研究進(jìn)展李堯(西南石油大學(xué),成都610500摘要:二羥基丙酮及其衍生物作為一種重要的化工、生化原料,在精細(xì)化工、制藥、食品、化妝品工業(yè)和水質(zhì)凈化等方面潛在廣泛的應(yīng)用前景。本文介紹了近年來(lái)發(fā)酵法生產(chǎn)二羥基丙酮及其應(yīng)用研究的進(jìn)展,并對(duì)二羥基丙酮的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望.文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1671-6892(200705-0020-0004Review of the Production of Dihydroxy Acetone throughMicrobial FermentationLI Yao(Southwest Petroleum University,Che

2、ngdu 610500Abstract:Dihydroxy acetone and its derivatives are important chemical or biochemical materials,which have been widely applied in chemistry,pharmacy,food,cosmetic industry and purification of water.Dihydroxy acetone produced by fermentation methods were introduced in this paper.Key words:m

3、icrobial fermentation ;dihydroxy acetone(DHA收稿日期:2007-08-31四川食品與發(fā)酵Sich u a n Food a n d Fe r m e n t a t ion二羥基丙酮(dihydroxyacetone ,DHA是一種水溶性的最簡(jiǎn)單酮糖,其衍生物是有機(jī)化學(xué)合成中非常重要的一類中間體。由于二羥基丙酮及其衍生物作為一種重要的化工、生化原料,在精細(xì)化工、制藥、食品、化妝品工業(yè)和水質(zhì)凈化等方面潛在廣泛的應(yīng)用前景,因此受到國(guó)內(nèi)外研究者廣泛重視。本文就國(guó)內(nèi)外DHA 生產(chǎn)應(yīng)用研究進(jìn)展作一介紹,為DHA 生產(chǎn)和應(yīng)用研究者提供一定的參考。1二羥基丙酮生產(chǎn)

4、方法DHA 的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成和微生物發(fā)酵兩種方法。最常見的二羥基丙酮化學(xué)合成方法主要有一溴丙酮酯化醇解法和1,2-丙二醇的氧氣或K 2Cr 2O 7/H 2SO 4氧化法兩種。前者反應(yīng)條件溫和、合成用生產(chǎn)設(shè)備要求低且簡(jiǎn)單、產(chǎn)品收率高、產(chǎn)品純度高,但主原料一溴丙酮的價(jià)格導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)高是該方法的最大缺點(diǎn);后者與前者剛好相反,反應(yīng)條件及設(shè)備要求高、需要用昂貴的金屬催化劑、產(chǎn)品收率不高,但原料成本低并可連續(xù)化或半連續(xù)化生產(chǎn)。第43卷(總第139期李堯微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥的丙酮其應(yīng)用研究進(jìn)展與化學(xué)合成法相比,微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、底物利用率高、生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少

5、,同時(shí)微生物發(fā)酵制備的DHA可應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域等優(yōu)點(diǎn),成為人們研究的重點(diǎn)。微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)DHA的機(jī)理就是利用微生物代謝產(chǎn)生的甘油脫氫酶,使甘油分子結(jié)構(gòu)中2位C上的羥基進(jìn)行脫氫反應(yīng),生成DHA。因此凡是能夠利用甘油,并且具有相應(yīng)的甘油脫氫酶系的微生物,都可以轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)DHA。但是具有生物轉(zhuǎn)化DHA工業(yè)價(jià)值的微生物主要是醋酸桿菌、葡萄糖酸桿菌、酵母和脈孢菌等,其中醋酸桿菌屬的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的重要菌種1。氧化葡萄糖酸桿菌是一種專性好氧的G-菌,屬于醋酸桿菌科(Acetobacteraceae。在麥芽汁瓊脂和酵母膏葡萄糖瓊

6、脂平板上的菌落呈圓形,乳白到微黃色,有時(shí)中央變褐或周圍帶黃色。在酵母膏葡萄糖酸瓊脂上生長(zhǎng)良好,形成或不形成5-酮基葡萄糖鈣結(jié)晶。在含酵母膏、乙醇、CaCO3瓊脂上生長(zhǎng)良好,并產(chǎn)生乙酸,溶解CaCO3,平板上呈透明圓圈。其生長(zhǎng)最適溫度2530,最適pH5.56.0。氧化葡萄糖酸桿菌含有多種酶類,有些酶可以催化氧化一系列底物。Asakura2等研究發(fā)現(xiàn),G.oxydans 中的葡萄糖脫氫酶、葡萄糖酮酸脫氫酶和醛糖脫氫酶都能夠作用于多種化合物,而且G.oxydans中幾乎所有的葡萄糖脫氫酶活性及一半的葡萄糖酮酸脫氫酶活性來(lái)源于L-山梨糖/L-山梨酮脫氫酶。同時(shí)大多數(shù)的此類酶位于細(xì)胞膜上,只有少數(shù)在細(xì)

7、胞漿中,在催化底物反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需底物和產(chǎn)物的透膜運(yùn)輸,大大提高了其應(yīng)用價(jià)值,因此,氧化葡萄糖酸桿菌廣泛應(yīng)用于二羥基丙酮、維生素C、D-葡糖酸等工業(yè)化生產(chǎn),具有非常高的工業(yè)價(jià)值。1.2.3發(fā)酵法生產(chǎn)二羥基丙酮的碳源、氮源Gluconobacter oxydans轉(zhuǎn)化甘油生成DHA分初級(jí)、次級(jí)兩個(gè)發(fā)酵階段。初級(jí)發(fā)酵階段以培養(yǎng)足量的菌體,用于次級(jí)發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘油生成DHA為目的。Gluconobacter oxydans能利用單糖或者糊精作為碳源,尤其是山梨醇,甘露糖醇,果糖和葡萄糖,其中山梨醇發(fā)酵效果最好。在菌體生長(zhǎng)階段的初級(jí)發(fā)酵階段,要盡量避免甘油作為一個(gè)能量來(lái)源和碳源,防止二羥基丙酮的形成。因?yàn)槎?/p>

8、羥基丙酮產(chǎn)物的存在會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng),影響次級(jí)發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA。初級(jí)培養(yǎng)階段最好氮源是酵母膏,當(dāng)然其它已知氮源,如氨基酸、玉米漿等也可以作為氮源,用于發(fā)酵生產(chǎn)DHA。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酵母膏的最適含量在3g/l6g/l之間。在微生物的轉(zhuǎn)化甘油合成DHA的整個(gè)過(guò)程中,發(fā)酵液中甘油和DHA的含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量起著決定性的作用。在生產(chǎn)過(guò)程中,如果甘油初始量越高,早期積累的二羥基丙酮越高,則菌體繁殖會(huì)受到不可逆轉(zhuǎn)的抑制,經(jīng)過(guò)大約20h-30h之后,菌體生長(zhǎng)的能力就會(huì)減弱,甚至停止生長(zhǎng),菌體轉(zhuǎn)化甘油生成DHA能力隨之減弱或停止。所以甘油的初始量一般不能過(guò)高。發(fā)酵液中轉(zhuǎn)化甘油的含量一般為5%20%。Gluc

9、onobacter oxydans轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)DHA的pH適宜范圍大約在3.84.8之間,而最適pH為4.04.5。pH的調(diào)節(jié)通常是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加鈣氧化物來(lái)解決,而且低濃度鈣離子的存在,促進(jìn)甘油脫氫酶轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)DHA。鈣離子的濃度在1g/ l5g/l之間較好。發(fā)酵溫度在2834范圍內(nèi),最適發(fā)酵溫度3032。近年來(lái),國(guó)內(nèi)研究者對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)DHA的工藝進(jìn)行了一些有意的探索。馮屏3等在間歇培養(yǎng)基礎(chǔ)上,利用膜生物反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵制取二羥基丙酮?？疾榱瞬煌视蜐舛?、培養(yǎng)基組分和流速對(duì)于連續(xù)發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)特性和二羥基丙酮產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明:甘油濃度為60g/l、玉米漿和蛋白水解液濃度為0.5g

10、/l、稀釋率為0.067h-1時(shí),菌體積累、甘油轉(zhuǎn)化率和體積產(chǎn)率均較高,最長(zhǎng)連續(xù)發(fā)酵持續(xù)時(shí)間為400h。馮屏4等利用在非生長(zhǎng)培養(yǎng)基中弱氧化醋酸桿菌(Acebobacter Suboaxydans靜止細(xì)胞發(fā)酵甘油制備DHA。通過(guò)改變培養(yǎng)條件,研究了影響靜止細(xì)胞氧化特性的因素。結(jié)果表明,處于非生長(zhǎng)期的弱氧化醋酸桿菌表現(xiàn)出穩(wěn)定的高氧化活性,DHA轉(zhuǎn)化周期縮短,獲得了較高產(chǎn)率。此外考察了弱氧化醋酸桿菌靜止細(xì)胞在重復(fù)利用多批次發(fā)酵中的氧化穩(wěn)定性,經(jīng)重復(fù)利用9個(gè)批次后,菌體細(xì)胞仍保持較高的氧化212007年第5期四川食品與發(fā)酵活性。當(dāng)甘油濃度為60g/l時(shí),DHA總產(chǎn)量可達(dá)49.16g,甘油平均轉(zhuǎn)化率為9

11、1%,體積產(chǎn)率為8.97g/ (L.h,較生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)提高1015倍。由于發(fā)酵終產(chǎn)物二羥基丙酮與反應(yīng)物甘油在化學(xué)結(jié)構(gòu)及物理性質(zhì)上的相似性,使得從發(fā)酵液中分離純化DHA比較困難,目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道有關(guān)DHA發(fā)酵產(chǎn)物提取方法有直接濃縮結(jié)晶,溶劑萃取和膜分離等方法。美國(guó)專利(專利號(hào)5,770,41采用直接濃縮結(jié)晶法,在2l發(fā)酵溶液中加入22g碳酸鋇,攪拌15min后,添加助濾劑(如活性炭、陽(yáng)離子樹脂等除去菌體、色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),最后再通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂收集洗脫液,在真空下直接濃縮結(jié)晶后得到176g DHA產(chǎn)物。但該方法要反復(fù)洗脫,生產(chǎn)周期較長(zhǎng)。美國(guó)專利(專利號(hào)4,076,589介紹了通過(guò)溶劑萃取法分

12、離二羥基丙酮,在發(fā)酵液中加入陽(yáng)離子酰胺,考慮到雙羥基化合物可與醛類發(fā)生可逆縮醛反應(yīng)而將羥基屏蔽,得到的化合物的親水性大大降低,可使用普通物理萃取將縮醛反應(yīng)的產(chǎn)物分離,再通過(guò)可逆水解得到富集和純化后的雙羥基化合物,最后通過(guò)膜分離反應(yīng)器100減壓分離,蒸干后得到二羥基丙酮結(jié)晶。馮屏3等利用膜生物反應(yīng)器(MBR連續(xù)發(fā)酵制取二羥基丙酮,通過(guò)膜的選擇性濾過(guò)作用,即時(shí)引出產(chǎn)物,使菌體和產(chǎn)物DHA隨時(shí)實(shí)現(xiàn)分離,避免了產(chǎn)物DHA在菌體細(xì)胞周圍的高濃度積累,消除了產(chǎn)物對(duì)菌體的抑制?？墒股镛D(zhuǎn)化的平衡反應(yīng)向所需方向移動(dòng)從而獲得較高的催化穩(wěn)定性,得到不含細(xì)胞的澄清透過(guò)液,使反應(yīng)和分離同時(shí)進(jìn)行,大大簡(jiǎn)化了后續(xù)分離純化

13、過(guò)程。2二羥基丙酮應(yīng)用二羥基丙酮是一種天然存在的酮糖,具有生物可降解性,可食用且對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒害;其化學(xué)性質(zhì)活潑,是一個(gè)重要的化學(xué)合成中間體,也是一種具有多種功能的添加劑,廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品和化學(xué)合成工業(yè)。二羥基丙酮最大特點(diǎn)之一就是具有極強(qiáng)的防曬性,利用這一特性,國(guó)外已成功開發(fā)了各種保護(hù)皮膚效果極佳的化妝液。這種新型化妝液除了與許多傳統(tǒng)化妝液一樣,能在皮膚上形成薄膜防止水分蒸發(fā)外,DHA進(jìn)入皮膚深層后,還能起到防紫外線灼傷皮膚的功效。2.2用于治療白斑、白癜風(fēng)白斑影響美容,研究表明用0.2%5%二羥基丙酮酒精溶液涂于患部,可使其接近正常皮膚。另外,在白癜風(fēng)白斑處搽二羥基丙酮復(fù)合液(二

14、羥基丙酮2.0g,維生素B200mg,二甲基亞砜100ml,照射He-Ne激光10min,治療處重搽二羥基丙酮復(fù)合液,其治療白癜風(fēng)總有效率達(dá)92.5%以上。二羥基丙酮可直接作為一種抗病毒試劑,如在雞胚胎培養(yǎng)中,使用DHA能大大抑制雞瘟病毒的感染,殺死51%100%的雞瘟病毒。以DHA為中間體在合成相應(yīng)的衍生物,可具有抗艾滋病病毒的作用。Stanko5等就正常膳食中長(zhǎng)期添加DHA和丙酮酸對(duì)小鼠機(jī)體組成成分影響研究結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組鼠體重增加明顯減少。尸檢發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組鼠體脂含量比對(duì)照組低32%,而兩組鼠的蛋白質(zhì)和水含量沒有顯著差異,實(shí)驗(yàn)鼠糞便熱量損失沒有增加,機(jī)體代謝率和血甲狀腺素水平上升,而脂肪合成

15、速率和血漿胰島素濃度下降。因此,實(shí)驗(yàn)組鼠體重的減少可能是由于儲(chǔ)存脂類消耗增加,并以熱能形式散失所致。以豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,也獲得了同樣的結(jié)果。日本科技人員經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明,豬飼料中加入4%的二羥基丙酮和丙酮酸鹽(鈣鹽的混合物(按3:l的重量比配合,能減少豬肉的脂肪含量,增加瘦肉率。2.6用于二羥基丙酮衍生物的合成7二羥基丙酮分子中含有三種官能團(tuán)(兩個(gè)羥基、一個(gè)羰基,化學(xué)性質(zhì)活潑,廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學(xué)反應(yīng),是一個(gè)重要的化學(xué)合成中間體。二羥基丙酮作為中間體用于有機(jī)化學(xué)合成衍生物時(shí),可用于羥醛縮合反應(yīng)制取各種手性化合物;經(jīng)生物或化學(xué)法還原可得到具有光學(xué)活性的仲醇;直接用于光化學(xué)反應(yīng)中的Diels-

16、Alder加成反應(yīng)制備糖類化合物或經(jīng)進(jìn)一步反應(yīng)用于該類加成反應(yīng);與卡賓發(fā)生插入反應(yīng);與2,2-二烷氧基環(huán)丙烷衍生22第43卷(總第139期李堯微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥的丙酮其應(yīng)用研究進(jìn)展物作用制備內(nèi)酯;用于制備一些橋環(huán)化合物進(jìn)而開環(huán)得到眾多有用的環(huán)狀化合物。3二羥基丙酮商品規(guī)格DHA外觀為白色粉末;具有特殊的臭味;熔點(diǎn)為7580(單體和二聚物的混合物,雖然一般狀態(tài)下是以二聚體(1,4-Dioxane形式存在的結(jié)晶,但是,經(jīng)溶解或加熱后則變?yōu)閱误w;可溶于水、乙醇、乙醚和丙酮中。大白鼠急性毒性:LD50>16000mg/ kg。在市售的商品中,有醫(yī)用級(jí)和化妝品級(jí),商品規(guī)格表1所示8由于二羥基丙酮及

17、其衍生物在化工、制藥、化妝品和食品工業(yè)上具有廣泛用途,市場(chǎng)前景廣闊。國(guó)外20世紀(jì)6070年代開始用生物轉(zhuǎn)化法工業(yè)化生產(chǎn)DHA,如日本的化學(xué)工業(yè)”公司,獨(dú)自開發(fā)的用甘油發(fā)酵制備DHA技術(shù),早在2001年日本國(guó)內(nèi)產(chǎn)量就達(dá)到了大約為1.0×105kg/t,其中50%用做醫(yī)藥化工合成中間體,日本國(guó)內(nèi)用做化妝品DHA大約為1.0×104kg/t。2003年,日本DHA醫(yī)藥級(jí)價(jià)格為40005000日元/kg,化妝品級(jí)價(jià)格為70008000日元/kg。公司在海外(德國(guó)的主要廠商,年生產(chǎn)DHA能力大約為1.0×106kg。與目前國(guó)外已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)DHA相比較,從國(guó)內(nèi)有

18、關(guān)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA 報(bào)道來(lái)看3、4、9,發(fā)酵生產(chǎn)菌種的產(chǎn)率都不是很高,用于工業(yè)化生產(chǎn)相對(duì)來(lái)說(shuō)成本一定會(huì)比較高,因此目前迫切需要選育DHA高產(chǎn)菌種,提高甘油轉(zhuǎn)化成DHA效率,降低生產(chǎn)成本,早日實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)DHA,以滿點(diǎn)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)DHA的需求。參考文獻(xiàn):1Bories A,Claret C,Soucaille P.Kinetic study and optimisation of theproduction of dihydroxyacetone from glycerol using Glu conobacter oxydans Process Biochemistry,199

19、1,26:243-248.2Asakura A,Hoshino T.Isolation and characterization of a new quinoprtein dehydrogenase,L-sorbose/L-sorboson dehydrogenase Biosci.Biotechnol.Biochm,1999,63(1:46-53的研究.食品與發(fā)酵工業(yè)J.2003,12(29:40-434馮屏,周家春,嚴(yán)?？?徐玉佩,弱氧化醋酸桿菌靜止細(xì)胞氧化活性的研究及1,3.二羥基丙酮的制備.食品與發(fā)酵工業(yè)J.2005,6(31:22-26 5Stanko,R.T.,S.A.Adibi.Inhibition oflipid accumulation and enhancementofenergyexpenditure bythe addition ofpyruvatee and dihydroxyacetone toa rat diet.MetabolismJ.1986,35:182-1866Stanko,R.T.and J.E.Arch