選殖及分析擬似人類G蛋白結(jié)合接受體基因的功能

1、選殖及分析擬似人類G蛋白結(jié)合接受體基因的功能Cloning and Characterization of A Human PutativeG Protein-Coupled Receptor Gene 學(xué) 生 : 簡佳怡 (Chia-Yi Chien) 國立陽明大學(xué)生命科學(xué)系學(xué)士論文National Yang-Ming UniversityDepartment of Life ScienceBachelor Thesis中華民國八十九年五月May, 2000ABSTRACT 在整個人類基因體的研究過程中，如何鑑定新的人類基因及分析其功能是其中重要的一環(huán)。利用基因庫的資料，我們首先鑑定出一個未

2、曾被發(fā)現(xiàn)的人類基因-BB29 DNA序列。透過選殖的步驟整個BB29基因的coding region 已經(jīng)被選殖出來。BB29的基因大小共含有1125個核甘酸，能夠合成375個amino acids，其amino acid sequence裡含有七個hydrophobic regions，在結(jié)構(gòu)上類似seven transmembrane domain protein，因此極可能是個新的G-protein coupled receptor。此外，我們也發(fā)現(xiàn)BB29之a(chǎn)mino acid sequence與多種其他生物存在的基因序列之間具有高度的相似性，顯示這些基因在演化的過程中被完整的保留下來

3、，它們在細(xì)胞功能上可能都扮演重要的角色。我們著手研究BB29 基因的生化及分子生物學(xué)特性，目前從human tissue blotting的結(jié)果，顯示BB29的表現(xiàn)並沒有組織專一性。由表現(xiàn)的一條約2.4 kb專一的 transcript判斷BB29在人類細(xì)胞中應(yīng)為單一的基因。利用間接免疫螢光法我們發(fā)現(xiàn)BB29 protein的表現(xiàn)位於細(xì)胞膜上。另一方面利用酵母菌Saccharomyces cerevisiae 當(dāng)作一個研究模式，藉由研究酵母菌細(xì)胞內(nèi)與BB29序列相似的兩個基因，來幫助我們瞭解BB29的功能。實驗初步的結(jié)果，將這兩個酵母菌基因破壞後，顯示這兩個基因為nonessential ge

4、ne，並且突變的細(xì)胞在平常的生長狀況下，細(xì)胞的形態(tài)、生長速度並沒有明顯的改變，此外在不同的碳源環(huán)境下，包括glycerol、oleate和raffinose，突變的細(xì)胞也依然可以存活，比較正常細(xì)胞和突變細(xì)胞的形態(tài)也沒有顯著的差別，表示這兩個基因產(chǎn)物在細(xì)胞利用這些碳源的能力中，並非必需的。最後我們也證明雖然這兩個酵母菌基因產(chǎn)物具有類似mating factor receptor的構(gòu)造，但它們並不直接參與細(xì)胞交配的機(jī)制。INTRODUCTION 人類基因體計劃將於最近完成，屆時人類所擁有的30億個遺傳密碼將完全被定序出，估算人類約擁有14萬個基因，而其中功能已知的基因數(shù)目卻不及十分之一。因此如何探

5、討剩下90%未知功能之人類基因所可能具有的生物活性，乃成為二十一世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)研究中最大的挑戰(zhàn)(1)。其中一個研究的途徑是以和現(xiàn)有人類基因庫做比對的方法，來鑑定及分析人類未知基因的特性及功能。我們實驗室從人類肝癌細(xì)胞的phagemid cDNA library 中任意挑了1000 個cDNA clones，經(jīng)初步定序之後，將這些cDNA的部分序列，個別與human expressed sequence tags (ESTs) database做比對，先將一些部分序列重疊的clones，利用電腦軟體 (sequencher) 加以分析，因此得到一些可能含有open reading frames (

6、ORFs) 的DNA序列片段，再將這些序列和NCBI的non-redundant GeneBank 比對，在所得到的結(jié)果中刪除一些已知基因的clones，留下可能是novel的部分，最後分別利用microarray的方法，分析這些基因在normal cell 與cancer cell 中的表現(xiàn)程度有無差異，由此得到的positive clones再進(jìn)行完整的序列分析。在我們的初步選殖中發(fā)現(xiàn)有一個novel clone，我們稱之為BB29 (Fig.1) 。 雖然BB29 在microarray的結(jié)果，顯示此基因在normal cell與cancer cell 的表現(xiàn)量並無顯著的差異，但是利用B

7、B29序列搜尋資料庫，發(fā)現(xiàn)BB29在mouse， Caenorhabditis elegans, Schizosaccharomyces pombe和Saccharomyces cerevisiae 等四種生物之基因組中存在具有高度相似性的基因 (Fig.2) ，另外分析BB29和這些序列相似的基因，在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)上，其厭水性質(zhì)的amino acid sequences，皆呈現(xiàn)含有七個conserved transmembrane domains (Fig.3)，因此推測它們可能都是G protein coupled receptors(23)。由於BB29和這些在其他生物發(fā)現(xiàn)的相似基因都

8、是novel genes，並且由它們序列之間的高度相似性，顯示這些基因在整個演化過程中被完整地保留下來，推測BB29在人類細(xì)胞中可能扮演一個重要的功能，因此值得我們進(jìn)一步的加以研究。為了能夠研究BB29的功能，我們將研究步驟設(shè)計成兩個方向同時進(jìn)行，第一個部分是直接對human BB29 clone的研究 。第二部分是利用酵母菌 S. cerevisiae 作為一個研究的模式。因為S. cerevisiae為簡單的單細(xì)胞真核生物，且其六千多個基因已完全被定序(9)，所有基因的序列資料，可以經(jīng)由網(wǎng)路資料庫中獲得，所以我們可以很容易利用重組DNA的技術(shù)來研究酵母菌的基因特性，甚至於可以很容易的利用遺

9、傳途徑來knock out 酵母菌的基因(20)，藉以瞭解該基因在活體細(xì)胞中的功能。由於我們發(fā)現(xiàn)在S. cerevisiae中擁有兩個ORFs : YOL002C與YDR492W，它們的amino acid sequences與BB29有極高的相似性(4, 22)，臆測它們可能在細(xì)胞中扮演相同的角色，因此藉由酵母菌的遺傳途徑來knock out 這兩個ORFs，然後觀察這兩個ORFs被knock out 後，對細(xì)胞生長有何影響，如果能夠因此產(chǎn)生任何的phenotype，再將BB29 clone 轉(zhuǎn)殖至突變的細(xì)胞，分析BB29 是否可以功能性互補(bǔ)這些突變細(xì)胞，希望由此得到一些有關(guān)BB29功能的線

10、索(3, 13)。 RESULTSCloning of the Human BB29 cDNA 為了能夠研究BB29的功能，首先即是轉(zhuǎn)殖出含有完整protein coding region 的BB29 cDNA。因為初步從人類肝癌細(xì)胞的phagemid cDNA library 中得到的BB29 cDNA，只含有cDNA的3' 端，其長度大約為1.2 kb，從sequence上判斷並不含完整的coding region。因此依據(jù)BB29 phagemid cDNA clone 已知的序列設(shè)計primers，以human HepT2 cells的mRNA 為模版，我們使用SMART RA

11、CE cDNA Amplification Kit (Clontech) 的方法作RT-PCR，得到大約1.25 kb的 BB29 5' 端fragment，將兩端合併後因此估算目前所擁有的BB29 cDNA clone長度大約為2.0 kb，其中包含了一個完整的open reading frame，而且也經(jīng)由DNA定序證實此cDNA clone 的DNA序列與利用EST序列組合得到的序列符合。整個BB29 的protein coding region，包含1125個核甘酸，能夠合成375個amino acids，預(yù)估其表現(xiàn)的蛋白質(zhì)分子量大約為41 kDa ( Fig.1 )。將此段c

12、DNA fragment 利用in vitro translation的方法表現(xiàn)出蛋白質(zhì)，其在SDS-PAGE上的electrophoretic mobility 大約為38 kDa，和預(yù)期的蛋白質(zhì)分子量極為相近 ( Fig.4 )。Northern Blot Analysis 為了瞭解BB29 在細(xì)胞中的特性，以Northern blotting方式檢測BB29在人體各種不同組織中分佈的形態(tài)。使用整個coding region 的BB29 cDNA fragment 當(dāng)作探針，先以32P-dCTP lable，再使用Human Multiple Tissue Northern Blot (C

13、lontech) 作hybridization，分析BB29的human tissue distribution，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BB29在Northern blot上的八種組織包含心臟、腦、胎盤、肺臟、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰臟都有表現(xiàn)，顯示BB29 kb專一的transcript (Fig.5)。這個實驗顯示BB29在人體細(xì)胞中應(yīng)該是單一的基因。同時根據(jù)BB29 transcript的大小，與實驗中所獲得cDNA長度相近，證實我們cloned 的BB29應(yīng)是接近full-length。在Northern analysis中，也使用glyceralaldehyde-3-phospate dehydro

14、genase (G3PDH) 的基因當(dāng)作對照組，以其表現(xiàn)的程度當(dāng)作標(biāo)準(zhǔn)值 (Fig.5)。Subcellular Localization of BB29 利用電腦軟體 ( MacVector ) 分析BB29 amino acid sequence，發(fā)現(xiàn)其具有七個hydrophobic domains，其序列和seven transmembrane domain 的保守性結(jié)構(gòu)具有共通性，推測BB29 protein可能也是個位在plasma membrane 的novel G-protein coupled receptor (GPCRs)。根據(jù)過去的研究指出GPCRs 之N端是露在extr

15、acellular domain，而C端則是在intracellular domain(23)。因此將N端以Flag 標(biāo)記的mammalian expression constructs轉(zhuǎn)染至293T cell，利用間接免疫螢光方法觀察BB29 protein的subcellular localization。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時後，首先將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分成兩組，一組使用acetone 處理，讓細(xì)胞膜具有通透性，另外一組細(xì)胞則不用acetone處理，分別用anti-Flag antibody ( mAb M2 )辨識，然後再用seconadry andidody : Rhodamine-conjuga

16、ted anti-mouse IgG染細(xì)胞。 初步的結(jié)果 ，可以看到轉(zhuǎn)染Flag-BB29 DNA 的細(xì)胞，在沒有acetone 處理下，很明顯地只看到在細(xì)胞膜上有Flag-BB29 protein 訊號，而細(xì)胞經(jīng)acetone 處理後，除了細(xì)胞核沒有外，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)皆有Flag-BB29的信號 (Fig.6)，所以BB29 protein應(yīng)位於plasma membrane上(18)。Characterization of Yeast Homologous GenesYOL002C & YDR492W Knockout Mutants 在酵母菌基因資料庫中，發(fā)現(xiàn)有兩個ORFs -

17、YOL002C與YDR492W的 amino acid sequence與BB29有高度的相似性，而且有類似seven transmembrane domain的結(jié)構(gòu)序列。因此可以利用酵母菌當(dāng)做model organism，將這兩個基因分別破壞後，觀察細(xì)胞是否有任何的phenotype，若有任何的phenotype，即可將BB29 cDNA fragment 轉(zhuǎn)殖至突變細(xì)胞內(nèi)，看看BB29是否可以功能性互補(bǔ)這些phenotype，如此將可以提供一些BB29功能的線索。 首先分別將YOL002C:LEU2 DNA fragment和YDR492W:TRP1 DNA fragment轉(zhuǎn)殖至JY19

18、5，用selective medium plates篩選出heterozygous mutants ，然後進(jìn)行sporulation 與 tetrad dissection，結(jié)果YOL002C和YDR492W heterozygous mutants的每個孢子囊之四個孢子都可以在YEPD plate生長，且四個孢子中，只有兩個可以在selective medium plate上生長，因此這兩個基因皆為nonessential gene。而那些可以在selective medium plate生長的孢子，即為YOL002C 或是YDR492W single konckout hapolid st

19、rain，這些突變的細(xì)胞將可以做為未來研究此兩個基因功能的材料。此外使用光學(xué)顯微鏡觀察在正常環(huán)境下生長的正常細(xì)胞與YOL002C或是YDR492W的突變細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們的細(xì)胞形態(tài)並沒有明顯的差異。 另外為了確定selectable yeast gene ( LEU2 or TRP1 gene) 是插在chromosome上欲破壞的基因內(nèi)，而不是置換了chromosome的leu2 gene或trp1 gene，因此個別萃取YOL002C (CCY103) 和YDR492W single konckout haploid cells (CCY108 、CCY109) 的genomic DNA，分別

20、用PR8 、PR9 和PR11 、PR12 primers ，利用PCR 的方法證實，結(jié)果各得到一個大約 kb ( YOL002C:LEU2 ) 和 3.0 kb ( YDR492W:TRP1 ) 的PCR產(chǎn)物 (Fig.7)，由此可以確定這些突變細(xì)胞的YOL002C或是YDR492W gene已被破壞。因為將酵母菌的YOL002C或是YDR492W gene個別破壞後，突變細(xì)胞在正常的生長環(huán)境下，並沒有明顯的phenotype，而YOL002C和YDR492W 它們的amino acid 序列之間有很高的identities ( 42.8% )，所以推測這兩個基因在細(xì)胞內(nèi)可能負(fù)責(zé)相同的功能，

21、接下來即是將這兩個基因同時knock out後，觀察細(xì)胞是否會有任何的phenotype。首先將相對交配型的YOL002C single knockout haploid cells和YDR492W single knockout haploid cells交配 ( CCY103 ×CCY109 ) ，由此得到heterozygous diploid mutants進(jìn)行sporulation 與 tetrad dissection，結(jié)果可以得到這兩個基因同時被knockout 的yeast haploid strain，並且觀察這兩個基因同時knock out後，突變的細(xì)胞與正常細(xì)胞

22、在形態(tài)上並無顯著的差異。Mating Ability of Knockout Mutants 細(xì)胞與細(xì)胞間的交互作用，對於多細(xì)胞生物的生長發(fā)育，扮演重要的角色。在單細(xì)胞的酵母菌，其haploid cells存在兩種不同的交配型，在生殖週期營養(yǎng)細(xì)胞會轉(zhuǎn)變成可以交配的細(xì)胞，不同的交配型釋放出不同的pheromone，與彼此的mating factor receptor結(jié)合，然後引發(fā)一連串的訊息傳遞，造成細(xì)胞分化而形成結(jié)合子(19)。而酵母菌細(xì)胞的mating factor receptor 具有七個transmembrane domains ，與YOL002C或YDR492W 基因產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)相

23、似，所以可以探討YOL002C或是YDR492W是否參與了交配的機(jī)制。由於不同交配型的YOL002C knockout haploid cell和YDR492W knockout haploid cells依然可以正常的交配，因此另外再將兩種相對交配型的YOL002C和YDR492W double knockout haploid strains進(jìn)行交配 ( CCY112 ×CCY113 )，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們?nèi)匀豢梢哉＝慌浼爱a(chǎn)生孢子，顯示這兩個基因應(yīng)該不直接參與交配作用。Growth Curve of Knockout Mutants YEPD medium 為實驗室培養(yǎng)酵母菌的 ri

24、ch medium ，內(nèi)含充分的養(yǎng)份，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長，而Synthetic complete (SC) medium 中所有的成分皆為人工合成，包含細(xì)胞所必需的碳源和氮源，只是營養(yǎng)成分較YEPD medium簡單。因此觀察正常細(xì)胞 ( CCY104 ) 和突變細(xì)胞 ( CCY102, CCY109, CCY112 ) 在YEPD或是SC medium下生長速率是否有任何差異。首先讓這四種細(xì)胞皆生長到mid-log phase，然後接種細(xì)胞到prewarmed medium內(nèi)，讓最初的濃度皆為1×106 cells / ml，每隔一段時間取出細(xì)胞測吸光值OD600 。初步的結(jié)果發(fā)現(xiàn)

25、正常細(xì)胞和突變細(xì)胞不管是在YEPD或是SC medium 中，生長速率皆沒有明顯的差別( )。Growth Effect of Various Carbon Sources 當(dāng)S. cerevisiae生長在以脂肪酸，例如oleate，為唯一的碳源環(huán)境時，一些負(fù)責(zé)產(chǎn)生 peroxisomal proteins的基因能因此被活化起來而產(chǎn)生一些peroxisomal -oxidation enzymes 及其它peroxisome-specific proteins，這些酵素的產(chǎn)生主要是幫助細(xì)胞能夠代謝脂肪酸之用。而這些基因活化的過程主要受到兩個轉(zhuǎn)錄因子Oaf1p和Pip2p的調(diào)控。不僅如此 ,

26、Pip2p本身也可以被oleate誘導(dǎo)而大量產(chǎn)生(16)。分析這些受Oaf1p和Pip2p調(diào)控的基因當(dāng)中，在promoter region 都有Oaf1p/Pip2p consensus binding site ，又稱作oleate responsive elements(5, 6)，根據(jù)最近的報導(dǎo)中藉由oleate responsive elements consensus sequence搜尋S. cerevisiae genomic database，發(fā)現(xiàn) YOL002C的promoter region也含有oleate responsive elements ，他們分析wild-ty

27、pe和 oaf1, pip2, oaf1pip2這三種突變種在各種不同碳源的生長環(huán)境中的基因表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YOL002C的表現(xiàn)的確受Oaf1p和Pip2p的調(diào)控，但與同樣其它受Oaf1p和Pip2p調(diào)控的 peroxisomal -oxidation enzymes 和peroxisome-specific proteins不同之處是YOL002C的表現(xiàn)卻反而受到oleate存在時的抑制(12)。一個可能的解釋是YOL002C的表現(xiàn)雖然也受到Oaf1/Pip2的調(diào)控，但僅限於低量或著是basal level的Oaf1/Pip2狀況下才對YOL002C有誘導(dǎo)作用，當(dāng)Oaf1/Pip2被oleat

28、e 誘導(dǎo)大量產(chǎn)生時，反而抑制它的表現(xiàn)。我們目前無法預(yù)知YOL002C在fatty acid metabolism中所扮演的角色。首先我們重複試驗並觀察所有YOL002C和YDR492W deletion mutants 在包含oleate為碳源的medium plate生長環(huán)境下的情形，將正常的細(xì)胞 ( CCY104 )與突變的細(xì)胞 ( CCY102, CCY109, CCY112 ) 塗在同一種test plate : YEPD, YPG, YPGO, YPR, YPRO plate，然後置30培養(yǎng)。結(jié)果每種細(xì)胞在相同的test plate 的生長狀況皆沒有顯著的差異。根據(jù)前人的實驗結(jié)果(1

29、2)， 發(fā)現(xiàn)在oleate為碳源的環(huán)境下，YOL002C的表現(xiàn)是被抑制的，因此嘗試在oleate medium 下大量表現(xiàn)YOL002C protein ，觀察細(xì)胞的生理現(xiàn)象及任何的phenotype。作法是將含有pYEX-BX-YOL002C或是pYEX-BX plasmid 的CCY102 transformant cell，同時培養(yǎng)在相同的test plate : YEPD , YEPD / 0.5 mM Cu2+ , YPG , YPG / 0.5 mM Cu2+, YPGO , YPGO / 0.5 mM Cu2+ , YPR , YPR / 0.5 mM Cu2+ , YPRO ,

30、 YPRO / 0.5 mM Cu2+。實驗初步的結(jié)果這兩種CCY102 transformant cell，在相同的test plate 上，生長狀況並沒有明顯的差異。DISCUSSION人類基因體計劃一旦完成之後，對人類其它未知功能基因的研究無疑地將是未來生物醫(yī)學(xué)研究的主要方向。在本計劃中，我們從鑑定出來的一個可能是人類細(xì)胞中的novel receptor clone-BB29著手，除了直接以人類細(xì)胞為材料，利用分子生物學(xué)技術(shù)來探測其功能之外，也採用了遺傳學(xué)的方法，利用酵母菌做為model organism來幫助我們了解BB29可能的作用。因此藉由酵母菌細(xì)胞中的兩個ORFs-YOL002C

31、和YDR492W為對象，我們以遺傳學(xué)的方法著手詢問這兩個基因在細(xì)胞內(nèi)的功能。在初步的實驗結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)YOL002C與YDR492W這兩個基因，不管單獨(dú)或是同時被knock out，突變的細(xì)胞在正常生長環(huán)境下，並沒有明顯的 phenotype，且觀察突變細(xì)胞與正常細(xì)胞在YEPD medium或是 SC medium 中的生長速率並沒有差異，初步結(jié)論這兩個基因在酵母菌細(xì)胞內(nèi)可能都不是在正常生長狀況下維持生命所必需。這樣的結(jié)果和推測此兩種基因產(chǎn)生receptor molecules 的功能並無衝突之處，因為目前所瞭解的各種生物的G protein coupled receptors皆非essenti

32、al genes，另外一個可能性是酵母菌細(xì)胞內(nèi)除了 YOL002C 及 YDR492W外可能還有其他基因也負(fù)責(zé)相同的功能，因此knock out 這兩個genes尚不致於造成明顯的phenotype，解決這個問題的方法是可以在將來使用yeast synthetic lethality screening的方法，來找到其他類似功能的基因(14)。未來將再研究突變的細(xì)胞是否會影響pseudohyphae 的形成 (8); 同時也將繼續(xù)探討它們是否會影響細(xì)胞接受外界環(huán)境的刺激與壓力的能力，例如osmotolerance ，thermotolerance，或是有關(guān)養(yǎng)分的攝取等等(2)。此外分析YOL0

33、02C與YDR492W的amino acid sequences也具有七個hydrophobic domains，另外也將轉(zhuǎn)殖可以在酵母菌細(xì)胞中表現(xiàn)的 GFP-tagged YOL002C或是YDR492W constructs至酵母菌細(xì)胞，利用螢光顯微鏡，觀察這兩個基因產(chǎn)物的subcellular localization ，是否在細(xì)胞膜上或位於其它的胞器(24)。根據(jù)最近的報導(dǎo)，分析S. cerevisiae genomic database後，發(fā)現(xiàn) YOL002C的promoter region 含有Oaf1p/Pip2p consensus binding site，又稱做oleate

34、 responsive elements ，他們實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)YOL002C的表現(xiàn)確實是受Oaf1p和Pip2p的調(diào)控，但與同樣其它受Oaf1p和Pip2p調(diào)控的 peroxisomal -oxidation enzymes 和peroxisome-specific proteins不同的地方，是在oleate存在的medium下，YOL002C的表現(xiàn)反而受到抑制，因此嘗試在不同的medium下，包括含有oleate的medium，在YOL002C knockout haploid strain 內(nèi)大量表現(xiàn)YOL002C protein，實驗初步的結(jié)果指出並細(xì)胞的生長並不受影響。但是此項實驗必須

35、再進(jìn)一步確定，因為目前我們無法確定pYEX-BX-YOL002C plasmid 在Cu2+ 的誘導(dǎo)下，真得可以表現(xiàn)出正確的protein，應(yīng)先要確定其序列是否正確，或是使用in vitro translation 的方法確定其是否可以表現(xiàn)出預(yù)期的蛋白質(zhì)，另外將再重新建構(gòu)其他同樣藉由Cu2+ 誘導(dǎo)表現(xiàn)，但有epitope-tagged 的plasmid ，然後利用新建構(gòu)的plasmid再重複試驗此項實驗，並利用western blotting來確定有YOL002C protein的表現(xiàn)。此外將利用另一種遺傳學(xué)的方法，建構(gòu)可以藉由galactose誘導(dǎo)大量表現(xiàn)YOL002C-HA或是YDR492

36、W-HA fusion protein的plasmid，分別送到Y(jié)OL002C或是YDR492W mutant haploid cell，然後再誘發(fā)表現(xiàn)大量的protein，觀察細(xì)胞是否會產(chǎn)生任何的phenotype，若沒有出現(xiàn)任何的phenotype，接下來實驗的方法先讓細(xì)胞經(jīng)由ethyl methyl sulfonate處理產(chǎn)生突變後，再促使YOL002C或是YDR492W protein大量表現(xiàn)，若細(xì)胞因此出現(xiàn)了任何的phenotype，利用yeast genomic library screening的方法，尋找可以互補(bǔ)此種phenotype的clone，若得到的complement

37、clone 為已知功能的基因，則我們研究的基因與complement clone 可能是參與了相同的生化反應(yīng)或生理作用，由此即可得到有關(guān)YOL002C或是YDR492W 功能的訊息(25)。在針對BB29 clone本身的研究方面，目前利用PCR的方法，已經(jīng)得到大約2.0 kb的cDNA fragment，其中包含1125 bp的open reading frame。另外利用Northern hybridization的方法，分析BB29在人類不同的組織中表現(xiàn)的情形，結(jié)果在八種組織中皆可以看到一條2.4kb BB29 transcripts，因此也確定了BB29是人類細(xì)胞中可以表現(xiàn)的基因，同時也証明我們目前的clone已經(jīng)接近full-length。 由BB29 的subcellular localization 的實驗結(jié)果，可以十分確定的是BB29 protein 並不存在細(xì)胞核內(nèi)，且BB29 protein 應(yīng)該為細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)。然而將可以產(chǎn)生Flag-BB29 fusion protein的plasmid轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞後，雖然acetone 處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用間接免疫螢光法，在細(xì)胞質(zhì)的部分也可以看到Flag-BB29 protein的信息，其可能的原因是細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)是經(jīng)由En