乙肝病毒表面抗原G145R變異單克隆抗體的制備及其初步鑒定

1、乙肝病毒表面抗原G145R變異單克隆抗體的制備及其初步鑒定 11-01-30 15:49:00 作者：張小艷編輯：studa20【摘要】 目的: 研制抗乙肝病毒G145R變異表面抗原的單克隆抗體(mAb)。方法: 將重組乙肝病毒G145R變異表面抗原以Al(OH)3佐劑化, 常規(guī)免疫BALB/c小鼠, 采用細(xì)胞融合技術(shù)制備抗乙肝病毒G145R變異表面抗原的mAb。采用ELISA對(duì)制備物的效價(jià)與特異性進(jìn)行鑒定, 將其用于部分臨床標(biāo)本的檢測(cè), 并與德國(guó)抗HBs mAb GL2.001進(jìn)行比較。結(jié)果: 獲得1株穩(wěn)定分泌抗G145R HBs mAb的雜交瘤細(xì)胞, 命名為4E12。該細(xì)胞株染色體數(shù)目為9

2、0條, 所分泌mAb屬IgG1亞類。其培養(yǎng)上清與腹水抗G145R HBs ELISA效價(jià)為(0.51)103及(110)106。經(jīng)持續(xù)3月培養(yǎng), 低血清適應(yīng)以及反復(fù)凍存與復(fù)蘇后, 其細(xì)胞增殖能力與上清抗G145R HBs效價(jià)與克隆化結(jié)束時(shí)大致相似。將其與德國(guó)抗G145R HBs mAb GL2.001相比, 二者對(duì)重組乙肝表面抗原G145R變異S蛋白的反應(yīng)性大致相當(dāng), 靈敏度前者稍低于后者（分別為2.0 g/L與1.0 g/L）。對(duì)野生株表面抗原的檢測(cè)前者在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未顯示有意義的反應(yīng)信號(hào), 后者在與高濃度（1 mg/L及以上）抗原反應(yīng)時(shí)S/N值達(dá)到或高于3.9。將二者用于對(duì)一組特定患者的

3、臨床檢測(cè), 其陽性率前者（17/200, 8.5%）較后者（11.5%）略低, 其差別經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論: 成功地制備了1株抗乙肝表面抗原G145R變異體的mAb, 為乙肝G145R變異的基礎(chǔ)、 臨床與流行病學(xué)研究提供了進(jìn)一步的物質(zhì)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒 免疫逃逸變異 HBsAg G145R變異 單克隆抗體新近資料顯示, 不同試劑對(duì)G145R變異HBsAg（mtHBsAg G145R）的檢測(cè)能力僅為對(duì)野毒型HBsAg檢測(cè) 的50 %或更低1, 這給HBV感染的免疫學(xué)診斷、 血源篩選和乙肝疫苗的研制提出了新的問題。為深入開展乙肝病毒免疫逃逸變異的臨床與流行病學(xué)

4、研究, 我們?cè)诩韧ぷ鞯幕A(chǔ)上采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行抗乙肝病毒表面抗原G145R變異單克隆抗體（抗G145R HBs mAb)的研究。1 材料和方法1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司; BALB/c小鼠由湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物室提供; Al(OH)3凝膠和重組野生HBsAg（wtHBsAg, CHO細(xì)胞表達(dá), 純化疫苗前體）等由中國(guó)生物制品總公司武漢生物制品研究所提供; Sp2/0細(xì)胞由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供; PEG4000、 HAT與HT、 以及小鼠免疫球蛋白亞類檢測(cè)試劑等均購自Sigma公司; 山羊抗小鼠IgG及HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購自美國(guó)Pierce公

5、司; HRP標(biāo)記山羊抗HBs多克隆抗體, 純化mtHBsAg G145R、 mtHBsAg G145RELISA質(zhì)控參照品及其抗HBs G6 mAb（下稱G6 mAb）等由本室制備2, 5。衛(wèi)生部國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心（NCCL）頒定之HBsAg ELISA質(zhì)控血清由湖北省臨床檢驗(yàn)中心提供?？笹145R HBs GL2.001.2 mAb由德國(guó)ESSEN大學(xué)病毒研究所陸蒙吉教授惠贈(zèng)（下稱 GL2.001 mAb, 該抗體能與mtHBsAg G145R結(jié)合）3。2A8細(xì)胞系（分泌mtHBsAg G145R）由本院臨床免疫研究室提供4。 受檢血清200份(年齡2056歲)自本院檢驗(yàn)科和感染病病原實(shí)驗(yàn)室采

6、集, 類型為: （1）臨床報(bào)告HBsAg呈陰性, 但有一項(xiàng)或幾項(xiàng)除HBsAb以外的HBV標(biāo)志物呈陽性; （2）HBsAg、 HBsAb雙陽性。正常對(duì)照血清40份, 均有成功的乙肝疫苗接種史, 抗HBs陽性, 其他HBV標(biāo)志陰性, 且生化指標(biāo)及其他肝炎病毒標(biāo)志均正常。1.2 方法1.2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立 （1）小鼠免疫:初次免疫用純化的 mtHBsAg G145R（5 g/只）與Al(OH)3混合置4過夜, 經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫。2周后, 用相同劑量的抗原及相同的方法進(jìn)行2次免疫。于細(xì)胞融合前3 d, 再用同等劑量的抗原(未佐劑化)腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。（2）細(xì)胞融合: 按本室以往報(bào)

7、道方法進(jìn)行6。（3）雜交瘤細(xì)胞的篩選: 采用ELISA A及ELISA B分兩步進(jìn)行, 用于篩選A法強(qiáng)陽性而B法陰性的雜交瘤細(xì)胞克隆。ELISA A: 先用山羊抗小鼠IgG包被（包被濃度2.5 mg/L）, 4過夜。次晨洗板5次, 每次1 min, 再以10 g/L的BSA封閉, 37放置2 h后, 加入待篩選的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清, 37反應(yīng)45 min, 洗板后依次與2A8細(xì)胞培養(yǎng)上清及HRP標(biāo)記的山羊抗HBs多克隆抗體反應(yīng), 反應(yīng)條件同上, 洗板后加TMBH2O2顯色15 min, 以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)并測(cè)定A450值。ELISA B: 以wtHBsAg包被（10 mg/L

8、）, 4過夜。洗板、 封閉同前。然后依次加入第一步篩選陽性的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG, 同前反應(yīng)（37反應(yīng)45 min）, 洗板后顯色并測(cè)定A450值, 以S/N2.1判為陽性。（4）克隆化: 共3次, 采用有限稀釋法。1.2.2 腹水制備與檢測(cè) 腹水制備采用降植烷腹腔誘導(dǎo)法。腹水蛋白含量檢測(cè)采用紫外比色法, 以BSA為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其總蛋白含量。1.2.3 雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定 采用秋水仙素分裂阻斷法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞染色體鑒定。1.2.4 抗體效價(jià)測(cè)定 采用ELISA A篩選法進(jìn)行。以P/N最接近2.1的反應(yīng)孔所加待測(cè)標(biāo)本稀釋度的倒數(shù)作為所測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清（或腹水）的效價(jià)。1.2

9、.5 小鼠mAb Ig亞類鑒定 采用膠體金免疫層析試紙條法, 按產(chǎn)品說明書操作。1.2.6 抗體的純化 腹水mAb經(jīng)飽和硫酸銨分級(jí)沉淀7后, 再以Protein A親和層析法進(jìn)行純化, 操作按試劑的說明書進(jìn)行。1.2.7 4E12ELISA方法的建立 采用純化的4E12 mAb包被, HRP標(biāo)記的山羊抗HBs多抗示蹤建立雙抗體夾心ELISA方法。并采用棋盤滴定實(shí)驗(yàn)對(duì)包被抗體和示蹤抗體進(jìn)行檢定。1.2.8 敏感性判定 將該方法用于檢測(cè)各個(gè)濃度的G145R變異重組HBsAg ELISA質(zhì)控參照品, 判定其檢測(cè)下限。并同時(shí)用GL2.001 mAb 進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。1.2.9 特異性判定 （1）抗原取代

10、實(shí)驗(yàn): 以4E12 mAb和GL2.001 mAb平行包被酶標(biāo)板, 分別加入2A8細(xì)胞培養(yǎng)上清, 濃度為5 mg/L、 1 mg/L、 100 g/L、 10 g/L、 1 g/L的wtHBsAg, NCCL頒定HBsAg ELISA質(zhì)控血清（10 g/L）, 狂犬疫苗, 腺病毒, 最后以HRP標(biāo)記的山羊抗HBs示蹤, 加TMD底物顯色后觀察結(jié)果。（2）抗體中和實(shí)驗(yàn): 以GL2.001 mAb包被酶標(biāo)板, 將4E12 mAb腹水系列稀釋成11011106, 與等體積2A8上清混合, 37溫育45 min, 將混合物分別加至包被板各相應(yīng)孔中, 每孔100 L, 同上溫育45 min后, 依次加入

11、HRP標(biāo)記的山羊抗HBs及TMD等做GL2.001ELISA, 并根據(jù)未中和孔計(jì)算各孔中和率。計(jì)算公式為: 阻斷率=（阻斷孔光密度值-陰性對(duì)照孔光密度值）/(非阻斷孔光密度值-陰性對(duì)照孔光密度值)100。1.2.10 GL2.001ELISA 其方法與4E12EL ISA同, 包被改用GL2.001 mAb, 具體操作見文獻(xiàn)報(bào)道2。1.2.11 G6 ELISA 用于上述兩法陽性標(biāo)本的復(fù)核, 其操作見文獻(xiàn)報(bào)道6。2 結(jié)果2.1 雜交瘤細(xì)胞的建立 常規(guī)融合、 篩選及克隆化后, 獲得1株可分泌高效價(jià)mAb的雜交瘤細(xì)胞, 命名為4E12 mAb。將此株雜交瘤細(xì)胞體外連續(xù)傳代20代并培養(yǎng)3個(gè)月以上, 反復(fù)凍存復(fù)蘇4次后, 其培養(yǎng)上清抗G145R HBs ELISA效價(jià)保持在(0.51)103范圍。2