咳喘寧對支氣管哮喘大鼠肺組織白細胞介素-5mRNA表達的影響

1、咳喘寧對支氣管哮喘大鼠肺組織白細胞介素-5mRNA表達的影響 11-05-09 15:18:00 編輯：studa20 作者：楊牧祥,于文濤,徐華洲,王曉紅【摘要】 目的 觀察咳喘寧對支氣管哮喘大鼠肺組織白細胞介素-5(IL-5)mRNA表達的影響。方法 40只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、咳喘寧高劑量組(27 g原藥材/kg體重)、咳喘寧低劑量組(13.5 g原藥材/kg體重)、桂龍咳喘寧對照組(0.41 g/kg體重),每組8只。除正常組外,以卵蛋白致敏并吸入激發(fā)法制備大鼠支氣管哮喘模型,各治療組均從第1次哮喘激發(fā)開始(造模第3周)至處死前每日灌胃給藥,激發(fā)并給藥4周后處死大鼠。采用RT

2、-PCR檢測IL-5mRNA表達,采用HE染色觀察肺和氣管病理組織學(xué)變化。結(jié)果 與正常組比較,模型組大鼠支氣管管壁和平滑肌厚度、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數(shù)以及肺組織IL-5mRNA表達明顯增加(P0.01)；與模型組比較,各治療組均可顯著降低支氣管管壁和平滑肌厚度、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數(shù)以及IL-5mRNA表達(P0.05或者P0.01)。結(jié)論 咳喘寧可降低肺組織IL-5mRNA的表達,抑制嗜酸性粒細胞在氣道的浸潤、聚集和活化,減輕哮喘氣道炎癥。 【關(guān)鍵詞】 咳喘寧；支氣管哮喘；白細胞介素-5；大鼠 Key words：Kechuanning；bronchial asthma；IL-5；rat

3、 支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞(EOS)、肥大細胞和淋巴細胞等多種炎癥細胞參與,白細胞介素-5(IL-5)、腫瘤壞死因子-(TNF-)等多種細胞因子介導(dǎo)的慢性氣道炎癥1?？却瓕帪檎n題組經(jīng)多年臨床觀察篩選的效方,為進一步闡明其作用機制,筆者觀察了該藥對支氣管哮喘大鼠肺組織IL-5mRNA表達和病理組織學(xué)的影響,現(xiàn)報道如下。1 材料與方法1.1 動物 清潔級SD大鼠40只,雌雄各半,體重180200 g,華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供,動物合格證號：SCXK1.2 藥物 咳喘寧炙麻黃、炒杏仁、紫菀、款冬花、五味子、炙百部、地龍、炙黃芪、太子參、桃仁、丹參等組成,使用前水煎分別濃縮成含量為2.

4、7 g原藥材/mL(高劑量組)和1.35 g原材藥/mL(低劑量組)的混懸液。桂龍咳喘寧膠囊：山西桂龍醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20053135,批號050706,0.3 g/粒,使用前用生理鹽水溶解成濃度為0.041 g/mL的混懸液。1.3 試劑及儀器 卵蛋白：美國Sigma公司生產(chǎn)；氫氧化鋁：天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn),分析純；Trizol：Invitrogen公司；DEPC：美國Sigma公司；DNA Marker：TaKaRa公司；RT、PCR反應(yīng)體系：北京塞百盛基因技術(shù)有限公司。主要儀器：美國PE9600型PCR擴增儀、北京六一電泳儀及電泳槽、法國BIO-PROFIF凝膠圖

5、像分析系統(tǒng)、北京鼎國紫外透射儀、彩云JWC-201D型超聲物化器、TP1020徠卡生物組織自動脫水機、EG1140徠卡石蠟包埋機、RM2050石蠟切片機等。1.4 分組及給藥 動物隨機分為正常組、模型組、咳喘寧高劑量組(高劑量組)、咳喘寧低劑量組(低劑量組)、桂龍咳喘寧膠囊對照組(桂龍咳喘寧組),每組8只。各治療組均從第1次哮喘激發(fā)開始(造模第3周)至處死前每日灌胃給藥,劑量見表1,正常組、模型組予0.5%的羧甲基纖維素鈉液灌胃,每日1次,連續(xù)4周。1.5 造模 參考文獻2方法,除正常組外,各組大鼠腹腔內(nèi)注射10%卵蛋白和10%氫氧化鋁混合液1 mL,致敏后第15日用1%卵蛋白噴霧激發(fā)大鼠哮喘

6、發(fā)作,隔日1次,每次20 min,共激發(fā)4周。以大鼠出現(xiàn)呼吸加快、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功。正常對照組以生理鹽水代替卵蛋白進行腹腔注射及霧化吸入。1.6 檢測指標(biāo)及方法 動物麻醉完全后,取右肺中葉,4%多聚甲醛固定,脫水、包埋、切片,分別做HE染色；取右肺近肺門處約100 mg,放入Eppendorf管,投入液氮罐,采用RT-PCR檢測IL-5mRNA表達。1.6.1 HE染色光鏡下觀察HE染色,并參照文獻3測量大鼠氣道壁的面積,并對氣管內(nèi)周長進行標(biāo)準(zhǔn)化。采用NYD1000型圖像分析軟件測定完整支氣管管腔的內(nèi)周長(Pi)、管壁面積(WA)、支氣管平滑肌的面積,用P

7、i進行標(biāo)準(zhǔn)化,分別以WA/Pi、支氣管平滑肌的面積/Pi表示支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度；同時測定每高倍視野(400倍)的EOS、淋巴細胞數(shù)。1.6.2 RT-PCR檢測IL-5mRNA表達1.6.2.1 總RNA的提取取肺組織50100 mg,放入勻漿器內(nèi),加入適量的Trizol用勻漿器勻漿,直至勻漿液呈無顆粒透明狀,然后轉(zhuǎn)移至新的離心管中,室溫靜置5 min,4 、12 000 r/min離心5 min。小心吸取上清液于另一離心管,加入1/5體積的氯仿,震蕩混勻后室溫靜置5 min,4 、12 000 r/min離心15 min。轉(zhuǎn)移上層水相到另一新離心管中,加入等體積的異丙醇,充分混

8、勻后室溫靜置10 min,然后4 、12 000 r/min離心10 min。RNA形成白色的小團沉淀在離心管的底部和側(cè)面,棄上清,加入75%的乙醇1 mL,4 、12 000 r/min離心5 min,盡量棄上清,漂洗23次RNA沉淀。最后,在無菌工作臺中干燥RNA沉淀510 min,加入DEPC處理的50 L雙蒸餾水,5560 溫育10 min使RNA充分溶解,取少許溶解的RNA,用TE Buffer稀釋后于紫外分光光度計260 nm和280 nm處讀取A值,A260/A2801.82.0間方可使用,總RNA濃度A260稀釋倍數(shù)0.04(g/L),用前調(diào)整為1 g/L。1.6.2.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取總RNA 2 g,加入RT反應(yīng)體系(含M-MLV Buffer、dNTPs、Oligo dT