持久穩(wěn)定的大鼠→小鼠造血嵌合體模型的建立(1)

1、持久穩(wěn)定的大鼠小鼠造血嵌合體模型的建立(1)】 目的： 建立持久穩(wěn)定的造血嵌合體模型. 方法： 將預處理后的SD大鼠經尾靜脈注射BALB/c小鼠骨髓細胞，誘導形成特異性耐受的嵌合體SD大鼠. 30 d后，再將此嵌合體大鼠的骨髓反向移植給致死性照射后的BALB/c小鼠，監(jiān)測小鼠的存活率，移植后30 d做皮片移植和混合淋巴細胞培養(yǎng)，觀察小鼠嵌合率的變化. 結果： 嵌合體模型小鼠僅有輕度移植物抗宿主病的表現，生存期明顯延長，移植后嵌合率較穩(wěn)定，移植皮片存活期延長，與對照組相比有顯著性差異. 結論： 通過輸入嵌合體骨髓的方法可建立穩(wěn)定持久的大鼠小鼠嵌合體模型.【關鍵詞】 嵌合體模型；全身照射；骨髓移植

2、0引言大鼠小鼠的骨髓移植，通過對受體進行強烈的清髓性預處理或注射大量骨髓以獲得可靠植活，但異種移植物抗宿主?。╔GVHD）較強，且嵌合狀態(tài)隨時間延長逐漸消失. 為建立穩(wěn)定的異種造血嵌合體，我們研究了協調性動物（大鼠小鼠）的骨髓移植模型，因為他們之間不存在天然的抗體，對異種移植物不會發(fā)生超急排斥(hyperacute rejection, HAR). 先對供者進行預處理，使其產生對小鼠的特異性耐受，再將此嵌合體大鼠的骨髓反向移植給小鼠. 由于此前嵌合體大鼠已對小鼠產生了特異性耐受，故將此耐受的骨髓植入小鼠體內可明顯減輕XGVHD，并誘導出持久穩(wěn)定的嵌合狀態(tài).1材料和方法SD大鼠(SPF級)8只，

3、雌性，810周齡. C57BL/6(H2b)小鼠6只，雌性，810周齡. BALB/c(H2 d)小鼠40只（包括在MLR和病理檢查中處死的小鼠，不編入各組計數），雌性，810周齡，均購自第一軍醫(yī)大學實驗動物中心,并飼養(yǎng)在清潔實驗動物中心層流倉. PE標記的抗小鼠H2DdmAb(PharMingen公司)；FITC標記的抗大鼠MHCCLASSmAb(Serotec公司)；3HTdR（中國原子能研究所）；60Co照射源(廣東省輻照中心)；流式細胞儀（FACScan; Becton Dickinson）；自動液閃計數器（Beckman, USA）.1.2.1嵌合體模型的建立SD大鼠于術前5 d開始

4、飲含紅霉素(250 mg/L)和慶大霉素(320 mg/L)的抗生素溶液. 無菌條件下取BALB/c小鼠骨髓細胞,制成單細胞懸液, SD大鼠接受8Gy（照射率0.5 Gy/min）全身照射(TBI)后4 h內經尾靜脈輸入BALB/c小鼠骨髓細胞2108/只,48 h后腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg1. 30 h后檢測外周血嵌合率為37.39%47.26%，證實小鼠源性骨髓已在大鼠體內植活. 取上述嵌合體SD大鼠骨髓細胞,制成單細胞懸液,BALB/c小鼠腸道凈化后接受9 Gy全身照射，隨即經尾靜脈輸入上述嵌合體骨髓細胞4107/只.1.2.2實驗分組以BALB/c小鼠為受鼠的A, B, C,

5、D, E組，均接受9 Gy的TBI預處理： A組（8只）輸注正常SD大鼠的骨髓細胞; B組（8只）輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細胞;C組（6只）為自體移植組，D組（6只）為預處理組，不輸注骨髓. 以無關第3者B6小鼠為受鼠的E組（6只）輸注嵌合體SD大鼠的骨髓細胞.1.2.3組織病理檢查出現移植物抗宿主病表現的小鼠,瀕死前活殺,B組存活者于移植后第60日處死，取其肝、小腸和皮膚標本,以100 mL/L甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色,光鏡下觀察. 按Thomas GVHD病理組織學分級標準判定2.1.2.4嵌合率的測定取移植后小鼠外周血,加入FITC標記的 抗大鼠MHCCLASSmAb(

6、每1106細胞中加入1 g),避光,4, 30 min. 紅細胞裂解液去掉紅細胞,PBS洗滌2次,流式細胞儀檢測嵌合率. 1.2.5皮膚移植及存活情況的觀察參考文獻3的方法,每日觀察皮毛,如變硬或脫落視為移植排斥,柔軟或鼠毛生長視為移植存活.1.2.6混合淋巴細胞反應（MLR）移植后30 d，分別取A,B組小鼠與正常BALB/c小鼠的脾細胞為反應細胞，以正常SD大鼠與Whistar大鼠脾細胞為刺激細胞，做混合淋巴細胞反應（MLR），絲裂霉素滅活刺激細胞，于96孔培養(yǎng)板每孔加反應細胞4105個和刺激細胞2105個，設自體反應孔，每組3復孔，培養(yǎng)96 h，終止培養(yǎng)前18 h，每孔加入3.7104

7、Bq（中國原子能研究所），液閃計數器測定，結果用Bq值xs表示.統計學處理： 實驗所得數據以xs表示, 采用SPSS12.0軟件進行數據分析. 用KaplanMeier估計與繪制生存曲線,用方差分析比較各組脾細胞增殖程度的差異，組間多重比較用LSD法，用秩和檢驗分析各組移植皮片的存活期，用t檢驗分析外周血白細胞計數和嵌合率.2結果2.1嵌合體模型的生存期A組在BMT后1 wk內出現體質量下降弓背體位、活動度差、毛臟亂等典型GVHD表現，第5日開始死亡并持續(xù)下去，僅25%存活超過60 d. B組出現輕微的GVHD, 62.5%存活，與A組比較有顯著性差異（Log Rank法比較，P0.05）.

8、C組均存活，D組均在BMT后10 d內死亡. 用KaplanMeier評估生存曲線 (Fig 1)顯示嵌合體骨髓細胞的輸入可顯著延長存活期，GVHD發(fā)生率及嚴重度降低. E組也出現嚴重GVHD 表現，60 d時存活率僅16.67%.作者：武小娟，李春富，唐湘鳳，石磊【關鍵詞】骨髓移植Establishment of stable ratmouse hematopoietic chimer 本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。2.2移植皮膚存活情況

9、BALB/c小鼠對特異供體SD及無關第三者Wistar皮膚的存活情況. 經秩和檢驗KruskalWallis H法分析，P=0.01，經多重比較，B組BALB/c小鼠對SD大鼠皮膚移植物的存活時間比A組明顯延長（Tab 1, P0.05).表1BALB/c小鼠異種皮膚移植物的存活情況（略）2.3混合淋巴細胞反應移植第30日A組與B組小鼠脾細胞對供體SD大鼠脾細胞的單向混合淋巴細胞反應明顯降低，經方差分析和LSD法的多重比較檢驗，與正常BALB/c小鼠相比P0.001， B組脾細胞增殖的抑制程度與A組有顯著差別（P0.05）. 移植后60 d的混合淋巴細胞培養(yǎng)結果與30 d時一致.2.4嵌合率測

10、定第30日時測定嵌合體模型的外周血嵌合率（Tab 2），經t檢驗B組外周血嵌和率與A組比較無顯著性差異. 但隨著時間推移，嵌合率逐漸下降， A組下降幅度較大，90 d時A組僅 為(12.400.32)% ，B組嵌合率仍有(23.774.50)% (P rat) bone marrow chimeras J. Ann Thorac Surg, 2001;72(3):740-745; discussion 745-746.8 Drevillon C, Elian N, Zinzindohoue F, et al. Prolonged improvement of total pancreatic

11、allograft function by previous intrathymic bone marrow cell injection in rats J. Eur Surg Res, 2003;35(1):1-5.9 van Pel M, Hilbrands L, Smits D, et al. Permanent acceptance of both cardiac and skin allografts using a mild conditioning regimen for the induction of stable mixed chimerism in mice J. Tr

12、anspl Immunol, 2003；11(1):57-63.10 Foster RD, Pham S, Li S, et al. Longterm acceptance of composite tissue allografts through mixed chimerism and CD28 blockade J. Transplantation, 2003;76(6):988-994.作者：武小娟，李春富，唐湘鳳，石磊【關鍵詞】骨髓移植Establishment of stable ratmouse hematopoietic chimer 本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。11 Waer M. Mixed bone marrow chimerism across discordant xenogeneic barriers: The solution for inducing xenotransplant tolerance J. Transplantation, 2000；69 (12