急性白血病細(xì)胞與正常白細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組分析(1)

1、    急性白血病細(xì)胞與正常白細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組分析(1)    】 本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法將急性白血病(acute leukemia，AL)細(xì)胞與正常白細(xì)胞進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析，為AL的分子診斷和白血病發(fā)生的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。利用二維凝膠電泳將40例AL患者的AL細(xì)胞和20例正常自愿者淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，利用MALDI-TOF-MS生物質(zhì)譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS) 對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果表明： 在AL細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，一些與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化（如Op18和

2、NM23-H1）、細(xì)胞增殖（如PCNA）、抑制凋亡（如腫瘤壞死因子抑制蛋白）等相關(guān)的蛋白在AL細(xì)胞中高表達(dá)，而一些與正常白細(xì)胞分化和生理功能相關(guān)的蛋白質(zhì)在AL細(xì)胞中低表達(dá)。結(jié)論： AL的發(fā)生涉及到眾多的細(xì)胞事件，一些與惡性轉(zhuǎn)化，細(xì)胞增殖和抑制凋亡等相關(guān)的蛋白在AL細(xì)胞中高表達(dá)，蛋白質(zhì)組學(xué)分析為急性白血病發(fā)病的分子機(jī)理的解析提供了一個新的手段。 【關(guān)鍵詞】 淋巴細(xì)胞Analysis of the Different Proteomes between the Acute Leukemia Cells and Normal White Blood CellsAbstract This study

3、was aimed to analyze the different proteomes between human acute leukemia (AL) cells and normal white blood cells by proteomic technology in order to lay the basis for diagnosing AL and understanding the mechanism of leukemogenesis. The proteins from AL cells of 40 AL patients identified by FAB clas

4、sification and proteins from normal lymphocytes and granulocytes of 20 normal volunteers were separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE)，and the differentially expressed proteins between the two groups were identified by both matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass s

5、pectrometry(MALDI-TOF-MS) and electronspray ionization(ESI)-MS/MS.The results showed that among the differentially expressed proteins between AL cells and normal lymphocytes and granulocytes，some proteins involved in the process of malignant transformation (such as Op18，NM23-H1)，cell proliferation (

6、such as PCNA) and apoptosis inhibition (such as tumor necrosis factor inhibitor protein) were found to be up regulated in AL cells.However，some proteins involved in differentiation and physiological functions of normal cells were down regulated in AL cells.It is concluded that there are many events

7、involved in the process of leukemogenesis，expression of some proteins relating to the malignant transformation，cell proliferation and apoptosis inhibition are up-regulated in AL cells. The proteome analysis may provide a new approach to explaining the molecular mechanism underlying the pathogenesis

8、of AL.Key words acute leukemia; lymphocyte; granulocyte    急性白血?。╝cute leukemia，AL）發(fā)生發(fā)展過程中涉及到眾多基因和表型變化，為了實(shí)現(xiàn)對AL的準(zhǔn)確診斷和特異性治療，研究者們一直致力于AL的分子特征的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是以整體蛋白質(zhì)作為研究對象，它為尋找AL的分子特征提供了一個全新的手段。本研究將AL細(xì)胞與正常淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞蛋白質(zhì)組特征進(jìn)行比較分析，以了解白血病發(fā)病機(jī)制和其生物學(xué)特征的分子基礎(chǔ)。      &#

9、160; 材料和方法主試劑和儀器硝酸銀、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺、過硫酸胺（APS）、TEMED均為Sigma公司產(chǎn)品、IPG干膠條（ImmobilineTM DryStrip，pH3-10，18 cm）、IPG緩沖液（IPG buffer，pH 3-10）購于Amersham Pharmacia，三氟乙酸購自Fluka公司，乙腈購自Fisher公司，經(jīng)修飾的測序級胰酶、蛋白酶抑制劑的混合片（cocktail tablets）購自Roche診斷公司。固相pH梯度等電聚焦儀（IPGphor IEF System）為Amersham Pharmacia

10、公司產(chǎn)品。垂直板蛋白電泳儀（PROTEAN xi Cell）為Bio-Rad公司產(chǎn)品。凝膠圖像掃描儀（ImageScanner）為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品。MALDI-TOF-MS為Bruker公司的Reflex III型質(zhì)譜儀，加速電壓為20 kV，為反射式正離子檢測方式。電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS/MS）為英國Micromass公司的正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-TOF2，配備有毛細(xì)管液相色譜和納升噴霧源，所有測定均在正離子模式下進(jìn)行。標(biāo)本來源標(biāo)本來源于吉林大學(xué)第一醫(yī)院血液腫瘤科40例依FAB分型方案初診為AL、未經(jīng)化療的患者的骨髓細(xì)胞（5例M1型，3例M2型，5例M3

11、型，6例M4型和6例M5型AL患者，15例急性淋巴細(xì)胞白血病患者），年齡17-60 歲(中位年齡42 歲)。正常標(biāo)本為20例健康志愿者外周血單個核細(xì)胞。樣品制備利用淋巴細(xì)胞分離液(相對密度1.077)梯度離心分離白血病患者骨髓細(xì)胞，取單個核細(xì)胞層，即為AL細(xì)胞。抽取健康自愿者抗凝外周血20 ml，Percoll梯度離心（具體操作見產(chǎn)品說明書，Amersham Pharmacia），產(chǎn)生3條細(xì)胞帶，其中最上層的帶1為淋巴細(xì)胞、帶2為中性粒細(xì)胞。顯微鏡下計數(shù)和觀察細(xì)胞形態(tài)（僅選用白血病細(xì)胞占骨髓單個核細(xì)胞90%以上的標(biāo)本和正常淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞占90%以上的標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)分析）。每5×107

12、個細(xì)胞加裂解液500 l（8 mol/L尿素，4% CHAPS，40 mmol/L Tris base，1×混合蛋白酶抑制劑），混勻后用液氮反復(fù)凍融2次。再加入20 g/ml DNase I和5 g/ml RNase A，冰浴20分鐘，4，10 000×g，離心30分鐘，取上清，Bradford法定量后將蛋白分裝，-70保存?zhèn)溆?。雙向凝膠電泳用雙向凝膠電泳（2-DE）1方法進(jìn)行細(xì)胞蛋白質(zhì)的分離，利用銀染2和考馬斯亮藍(lán)染色方法進(jìn)行電泳凝膠染色。凝膠圖像采集與分析染色后的雙向電泳凝膠用凝膠圖象掃描儀（Amersham Pharmacia Biotech）掃描。數(shù)字化圖像文件采用

13、Nonlinear Dynamics公司的二維電泳處理軟件（ImageMasterTM 2D Elite 3.01）分析，獲得每個蛋白點(diǎn)的分子量（Mr）、等電點(diǎn)（pI）及相對含量。Table. Differentially expressed proteins between AL and normal white blood cells identified by MALDI-TOF-MS            作者：崔久嵬，王冠軍，李薇，王杰，張學(xué)敏【摘】本研究利用蛋白質(zhì)

14、組學(xué)方法將急性白血病(acute leukemia，AL)細(xì)胞         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定在建立差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜之后，我們加大雙向電泳中的蛋白上樣量（0.5-1 mg），用考馬斯亮藍(lán)染色方法進(jìn)行染色，找到對應(yīng)的差異點(diǎn)，切出蛋白點(diǎn)后進(jìn)行脫色，膠內(nèi)胰酶酶切和肽段提取3，然后用MALDI-TOF/MS進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜（PMF

15、）分析4。進(jìn)一步用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)5對部分肽段測序后進(jìn)行檢索以確定MALDI-TOF/MS分析結(jié)果。檢索結(jié)果的可靠性用肽段匹配率、得分值（score）和匹配肽段在對應(yīng)蛋白內(nèi)的序列覆蓋率進(jìn)行評價。差異點(diǎn)的標(biāo)示鑒定出來的差異蛋白點(diǎn)標(biāo)示在相應(yīng)的分析膠上（銀染2-DE圖），在AL細(xì)胞與正常白細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)標(biāo)記為N。各差異點(diǎn)的順序號為本工作發(fā)現(xiàn)的先后順序。統(tǒng)計學(xué)分析用Newman-Keuls方法檢驗(yàn)差異蛋白點(diǎn)相對含量的差別是否有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié) 果2-DE圖譜的分析本研究的AL患者的骨髓標(biāo)本經(jīng)密度梯度離心，白血病細(xì)胞占單個核細(xì)胞的90%以上，正常淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞占90%以上。

16、經(jīng)ImageMaster 2-D Elite 3.0軟件及手工分析，每塊2-DE膠可分離近1 400左右個蛋白點(diǎn)，同一份標(biāo)本平行電泳的匹配率在95%以上，并且各蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度變化無顯著性差異。圖1A-B所示分別為正常淋巴細(xì)胞的2-DE圖譜（圖1A所標(biāo)識的蛋白點(diǎn)為AL細(xì)胞與正常淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞相比，在AL細(xì)胞中低表達(dá)的部分蛋白點(diǎn)）和ALL細(xì)胞2-DE圖譜（圖1B所標(biāo)識的蛋白點(diǎn)為在AL細(xì)胞中與正常淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞相比高表達(dá)的部分蛋白點(diǎn)），圖1C-D為相應(yīng)差異點(diǎn)在2-DE圖譜上的局部放大圖。        差異表達(dá)

17、點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定在建立各型AL細(xì)胞2-DE圖譜后，將在AL各型中均存在的區(qū)別于正常白細(xì)胞的蛋白點(diǎn)定義為差異表達(dá)點(diǎn)，我們加大雙向電泳中的蛋白上樣量（1 mg），用考馬斯亮藍(lán)染色方法進(jìn)行染色，找到對應(yīng)的差異點(diǎn)，切出蛋白點(diǎn)后進(jìn)行脫色、膠內(nèi)胰酶酶切和肽段提取，然后用MALDI-TOF/MS進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜（PMF）分析；進(jìn)一步用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)對部分肽段測序后進(jìn)行檢索。鑒定結(jié)果表明，大多數(shù)蛋白點(diǎn)的出峰情況較好，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測出部分肽段序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫查詢的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PMF檢索得到的結(jié)果。本研究蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定的詳細(xì)列表見附表。其中實(shí)驗(yàn)等電點(diǎn)和分子量是根據(jù)蛋白點(diǎn)在雙向電泳膠上的位置

18、，用圖像分析軟件分析后得到。圖2A-B為ESI-MS/MS對N-11蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定的PMF和序列分析的結(jié)果。    AL和正常白細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白AL和正常白細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白，是各型AL細(xì)胞都表現(xiàn)出與正常白細(xì)胞有差異的點(diǎn)，并不包括在AL各亞型中特異表達(dá)點(diǎn)。對41個AL和正常白細(xì)胞間的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示41個差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)對應(yīng)31個不同蛋白，具體鑒定結(jié)果如附表所示。其中在AL細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白，如NM23-H1、癌蛋白18（oncoprotein 18，OP18），（如圖1C所示，其蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度為正常白細(xì)胞的8-12倍）、增殖細(xì)胞核抗原

19、（PCNA）（如圖1C所示，其蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度為正常白細(xì)胞的12-20倍）、細(xì)胞凋亡抑制因子（其蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度為正常白細(xì)胞的6-8倍）、腫瘤壞死因子抑制蛋白（tumor necrosis factor inhibitor protein，TIP）（如圖1D所示，其蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度為正常白細(xì)胞的6-8倍）。與正常粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞相比，調(diào)節(jié)性肌動蛋白輕鏈-2（MLC-2）、調(diào)節(jié)性肌動蛋白輕鏈-3（MLC-3）(正常白細(xì)胞其蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度為AL細(xì)胞的8-11倍)和髓系相關(guān)蛋白-8 (Mrp8) 和Mrp 14 (正常白細(xì)胞的其蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度為AL細(xì)胞的14-20倍)在AL細(xì)胞中低表達(dá)。討 論蛋白質(zhì)是生理、病理過程

20、的直接執(zhí)行者，不同的疾病過程、不同的治療反應(yīng)、不同的預(yù)后必然由蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)間相互關(guān)系的改變所導(dǎo)致，當(dāng)mRNA豐度與蛋白質(zhì)含量不成正相關(guān)或牽涉到蛋白質(zhì)修飾等問題時，直接對白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行研究無疑是揭示細(xì)胞生命本質(zhì)特征的更重方案。以前對AL細(xì)胞蛋白質(zhì)分子特點(diǎn)的研究取得了一定進(jìn)展，但主集中在對個別或少數(shù)蛋白質(zhì)的作用進(jìn)行探討，而白血病發(fā)生涉及了眾多的細(xì)胞事件，因此有必用更高通量的方法，全面地分析AL細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)特點(diǎn)。    本研究應(yīng)用2-DE和質(zhì)譜技術(shù)等蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法對AL 和正常白細(xì)胞蛋白質(zhì)組特征進(jìn)行分析，以尋找二者蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜。雖然將白血病

21、細(xì)胞與其分化同階段的相應(yīng)的正常細(xì)胞相比較更有利于找到與AL發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，但由于目前技術(shù)的限制很難獲得分化為同一階段的純度（90%）較高的正常白細(xì)胞。本研究將AL細(xì)胞（由于M6、M7型AL少見，不包括在本研究中）和相應(yīng)正常的成熟淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析（其差異蛋白涉及到分化相關(guān)蛋白和白血病發(fā)生相關(guān)的蛋白），對AL診斷和發(fā)病機(jī)制研究具有重的臨床意義。    在AL和正常白細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白中，有一些與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和細(xì)胞異常增殖有關(guān)的蛋白在AL細(xì)胞中高表達(dá)。例如，OP18(oncoprotein 18)在細(xì)胞生長調(diào)節(jié)通路調(diào)控中起重作用

22、，利用反義核苷酸技術(shù)阻止OP18的表達(dá)，可使細(xì)胞增殖能力下降6。本研究顯示OP18是各型AL細(xì)胞胞漿的主組成成份。PCNA在調(diào)節(jié)DNA復(fù)制與細(xì)胞增殖過程中起重作用，其表達(dá)強(qiáng)度可以反映細(xì)胞增殖活性 7和腫瘤細(xì)胞的生長速度，PCNA 在AL細(xì)胞中較正常細(xì)胞中明顯高表達(dá)（N-1點(diǎn)），提示AL細(xì)胞較正常細(xì)胞具有高的增殖特性。TNF可使細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，而TIP能夠使細(xì)胞免于由TNF所誘導(dǎo)的凋亡8，本實(shí)驗(yàn)顯示TIP在AL中表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞（N-8點(diǎn)），提示其與AL細(xì)胞的免疫逃逸有關(guān)。在實(shí)體瘤NM23（N-11點(diǎn)）蛋白具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，而在造血系統(tǒng)，NM23在低分化的細(xì)胞中表達(dá)量高于相對分化細(xì)

23、胞，本實(shí)驗(yàn)顯示在AL細(xì)胞中較正常細(xì)胞高表達(dá)，與文獻(xiàn)報道一致9。    一些蛋白在2-DE上的位置與理論pI和Mr不符，或在2-D膠上表現(xiàn)出不同的蛋白點(diǎn)經(jīng)鑒定為同一蛋白質(zhì)，這與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾有關(guān)，如蛋白酶降解、糖基化和磷酸化。    我們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對AL細(xì)胞和正常白細(xì)胞進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組的研究，研究顯示AL細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜與其臨床表現(xiàn)及其形態(tài)特點(diǎn)呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，雖然獲得更全面的AL蛋白質(zhì)表達(dá)特征，需大量的工作，但本研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)組學(xué)方法為AL細(xì)胞分子特征的研究提供了一種新的有效研究手段，通過本研

24、究的擴(kuò)展有助于發(fā)現(xiàn)與白血病發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)分子機(jī)制。            作者：崔久嵬，王冠軍，李薇，王杰，張學(xué)敏【摘】本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法將急性白血病(acute leukemia，AL)細(xì)胞         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們

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