白介素2抑制T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答機(jī)制的研究

1、白介素2抑制T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答機(jī)制的研究    作者：張騰龍,謝彥暉,王纓,林果為【摘要】  本研究查明白介素2（IL2）對靜息T細(xì)胞抗原特異性免疫應(yīng)答的作用，探討IL2對靜息T細(xì)胞中細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3 )表達(dá)的影響，及其與抗原特異性免疫應(yīng)答的關(guān)系。用IL2（50 U/ml）預(yù)處理靜息DO11.10 T細(xì)胞，洗滌去除IL2后用3HTdR摻入法檢測靜息DO11.10 T細(xì)胞針對OVA323-329抗原(ovalbumin，OVA，卵清蛋白)的特異性增殖；用I

2、L2（50 U/ml）刺激靜息DO11.10 T細(xì)胞，然后用熒光實時定量PCR法檢測SOCS3在刺激后不同時間的表達(dá)變化；用OVA323-329抗原活化靜息DO11.10 T細(xì)胞，然后檢測SOCS3在抗原活化后不同時間的表達(dá)變化。結(jié)果表明：靜息DO11.10 T細(xì)胞經(jīng)IL2刺激后抗原特異性增殖能力減弱；靜息DO11.10 T細(xì)胞經(jīng)IL2刺激后SOCS3表達(dá)上調(diào)，在刺激4小時后表達(dá)即明顯上調(diào)，6小時后達(dá)到最高峰；靜息DO11.10 T細(xì)胞經(jīng)OVA323-329抗原活化后SOCS3表達(dá)明顯下調(diào)，在活化后第2天降至最低，4天后基本恢復(fù)正常。結(jié)論： IL2在一定條件下可抑制靜息T細(xì)胞抗原特異性免疫應(yīng)答

3、，而且這種抑制作用可能與SOCS3表達(dá)上調(diào)有關(guān)。【關(guān)鍵詞】  IL2；DO11.10 T細(xì)胞；SOCS3；OVA323-329抗原Abstract    The study was aimed to investigate the effect of IL2 on the acquired immune response of naive T cells，and to explore the influence of IL2 on  suppressor of cytokine signaling 3  (SOCS3) express

4、ion of naive T cells, as well as to elucidate the  role of SOCS3 on antigen specific immune response in vitro. Naive DO11.10 T cells were prestimulated with IL2 (50 U/ml), and stimulated with OVA323-329 antigen after removing IL2, then the proliferation of naive DO11.10 T cells was detected. Na

5、ive DO11.10 T cells were stimulated with IL2 (50 U/ml), and SOCS3 expression was detected by realtime PCR. Naive DO11.10 T cells were stimulated with OVA323-329 antigen, and SOCS3 expression was detected by means of 3HTdR. The results  showed that   after IL2 prestimulation, the proli

6、feration of naive DO11.10 T cells decreased significantly when stimulated with OVA323-329 antigen; SOCS3 expression of naive DO11.10 T cells was upregulated significantly after IL2 stimulation, the upregulation began obviously at 4 hours and reached peak at 6 hours. SOCS3 expression on naive DO11.10

7、 T cells was downregulated markedly after OVA323-329 antigen stimulation, the expression level  of SOCS3  was lowest on day 2 and returned to normal on day 4 after stimulation. It is concluded that  the antigen specific immune response of naive DO11.10 T cells is inhibited after prest

8、imulation with IL2,  which   may be mediated by SOCS3.Key words    IL2; DO11.10 T cell; SOCS3; OVA323-329 antigen白介素2（interleukin2, IL2）作為一種免疫增強(qiáng)制劑被廣泛應(yīng)用于腫瘤和艾滋病的臨床治療1，2，但只有大約20%的患者有治療效果3，而且在某些治療中應(yīng)用IL2后反而產(chǎn)生免疫抑制的現(xiàn)象4，其具體機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，IL2除能擴(kuò)大免疫反應(yīng)外，還可誘導(dǎo)免疫耐受，認(rèn)為這一作用可能與調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg細(xì)

9、胞）有關(guān)5。另外還有研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下IL2刺激T細(xì)胞可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)表達(dá)上調(diào)6，而SOCS3是機(jī)體免疫應(yīng)答的抑制因子7。因此，IL2可能通過誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá)來抑制T細(xì)胞對抗原的應(yīng)答。 為此， 我們以小鼠抗原特異性T細(xì)胞 （DO11. 10 T細(xì)胞）為研究對象，研究IL2對T細(xì)胞抗原特異性應(yīng)答的影響，同時研究T細(xì)胞免疫應(yīng)答與SOCS3變化的相關(guān)性。主要試劑與儀器TRIzoL購自北京鼎國生物公司，小鼠IL2為Sigma公司產(chǎn)品，realtime PCR Master Mix為Toyobo公

10、司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑與dNTP購自MBI公司，絲裂霉素為日本Kyowa公司產(chǎn)品，Taq DNA聚和酶購自Tiangen公司，所有引物均由上海生工生物公司合成。SN6904液體閃爍計數(shù)儀由上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠生產(chǎn)，LightCyclerTM定量PCR儀為Roche公司產(chǎn)品，PE 240型PCR儀為Perkin Elmer公司產(chǎn)品。動物DO11.10 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠為卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)抗原特異性小鼠，均為SPF級，雌性，6-8周齡，15-20 g，由中國科學(xué)院上海動物中心飼養(yǎng)。靜息DO11.10 T細(xì)胞（naive DO11.10 T cell）的IL2預(yù)處理頸椎脫臼法

11、處死DO11.10 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠，用尼龍毛柱分離DO11.10 T細(xì)胞，以RPMI  1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，鋪入24孔板中，每孔1×107/2 ml，然后加入濃度為50 U/ml的IL26，于37、5 C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SOCS3基因的檢測總RNA提取與cDNA制備  用IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細(xì)胞后每2小時裂解細(xì)胞（0、2、4、6、8、10、12小時），按照TRIzoL reagent操作說明抽提總RNA，溶解于10 l  DEPC水中。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以O(shè)ligodT為引物，操作按MBI試劑說明書進(jìn)行。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

12、  此制備的cDNA為模板，操作按Taq DNA聚和酶操作說明進(jìn)行，SOCS3引物上游序列為：5TGCGCCATGGTCACCCACAGC AAGTTT3，下游：5GCTCCTTAAAGTGGAGCA TCATACTGA3。熒光實時定量PCR（real timePCR）以上法制備的cDNA為模板，按realtime PCR Master Mix說明書進(jìn)行操作，SOCS3引物上游為：5CAAGTCATCACTATTGGCAACGA3,下游：5CC CAAGAAGGAAGGCTGGA3。actin引物上游:5CCAGCCATGTACGTTGCTATC3,下游: 5CA GGTCCAGAC

13、GCAGGATGGC3。DO11.10 T細(xì)胞抗原特異性增殖實驗首先將分離的靜息T細(xì)胞在含有IL2（50 U/ml）的RPMI 1640培養(yǎng)液中預(yù)處理6小時，洗滌去除IL2后加入96孔板中（1×105/well）。以絲裂霉素（100 g/ml）滅活的DO11.10 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞作抗原呈遞細(xì)胞（4×105/well）。OVA323-329特異性抗原終濃度為0.6 mol/L。37、5 CO2培養(yǎng)5天，終止培養(yǎng)前18小時加3HTdR (0.5 Ciwell)，用液閃計數(shù)儀測cpm值。本實驗設(shè)3個復(fù)孔，設(shè)未經(jīng)IL2預(yù)處理的靜息DO11.10 T細(xì)胞組為對照組。統(tǒng)計學(xué)分析

14、采用SPSS 13.0軟件處理，用單因素方差分析（oneway ANOVA）統(tǒng)計方法分析數(shù)據(jù)，P<0.01為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)    果IL2體外抑制靜息T細(xì)胞抗原特異性增殖IL2的所有作用都是通過與IL2受體（IL2R）結(jié)合來實現(xiàn)的。免疫應(yīng)答中，T細(xì)胞經(jīng)抗原活化后高表達(dá)CD25（IL2R亞基）,此時IL2作用于T細(xì)胞，能夠與CD25結(jié)合促進(jìn)T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。而T細(xì)胞未接受抗原活化前（靜息T細(xì)胞）基本不表達(dá)CD255，因此用IL2刺激靜息T細(xì)胞并不會促其增殖，但I(xiàn)L2對靜息T細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究以DO11.10轉(zhuǎn)基因小鼠靜息T細(xì)胞（靜息DO11.

15、10 T細(xì)胞，為OVA抗原特異性T細(xì)胞）作為研究對象。靜息DO11.10 T細(xì)胞經(jīng)尼龍毛柱法分離后用FACS鑒定純度可達(dá)90以上，在接受抗原特異性活化之前先用IL2預(yù)處理6小時，然后再用OVA323-329抗原刺激，最后用3HTdR摻入法檢測其針對OVA323-329抗原的特異性增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IL2預(yù)處理6小時的靜息DO11.10 T細(xì)胞的抗原特異性增殖較之正常對照組（靜息DO11.10 T細(xì)胞未經(jīng)IL2預(yù)處理組）明顯下降（P<0.01）（圖1）。IL2預(yù)處理靜息T細(xì)胞可以誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)上調(diào)由前面得知，IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細(xì)胞可以抑制其抗原特異性增殖，而未經(jīng)IL2預(yù)

16、處理的靜息DO11.10 T細(xì)胞的抗原特異性增殖未受抑制，導(dǎo)致這種差異的原因就在于T細(xì)胞在接受OVA323-329抗原刺激前是否經(jīng)過IL2的預(yù)處理。Cohney等6研究發(fā)現(xiàn)，IL2刺激T細(xì)胞可以誘導(dǎo)JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路的反饋抑制分子（SOCS3）蛋白的表達(dá)上調(diào)，因此我們進(jìn)一步檢測在IL2預(yù)處理的過程中是否伴有SOCS3表達(dá)水平的變化。realtime PCR法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細(xì)胞的過程中SOCS3的表達(dá)水平明顯改變（圖2）。在靜息T細(xì)胞經(jīng)抗原活化后SOCS3表達(dá)下調(diào)由前面得知，IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細(xì)胞可以抑制其抗原特異性增殖，同時伴有SO

17、CS3表達(dá)上調(diào)，因此我們進(jìn)一步探討其具體作用機(jī)制，研究SOCS3在T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著怎樣的作用。我們用OVA323-329抗原活化靜息DO11.10 T細(xì)胞，研究在正常免疫應(yīng)答狀態(tài)下抗原特異性活化對T細(xì)胞SOCS3表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DO11.10 T細(xì)胞經(jīng)OVA323-329抗原活化后SOCS3表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖3），在OVA323-329抗原活化后第1天即有明顯的下調(diào)，活化后第2天降至最低，第3天開始逐漸升高直至第4天基本正常。由于SOCS3在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用8，因此抗原活化后SOCS3的短暫下調(diào)與機(jī)體的免疫防御有關(guān)，有利于免疫應(yīng)答的迅速啟動，清除“異物”威脅，在

18、抗原活化后期恢復(fù)正常則與免疫自穩(wěn)有關(guān)，可以防止免疫過度擴(kuò)大造成損傷9。因此IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細(xì)胞可以誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)上調(diào)，使該T細(xì)胞在隨后的免疫應(yīng)答中不能將SOCS3下調(diào)至不影響免疫應(yīng)答啟動的水平，導(dǎo)致免疫應(yīng)答正常啟動受到影響，最終抑制該T細(xì)胞抗原特異性免疫應(yīng)答。討    論IL2是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，是增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫的重要介質(zhì)，目前被廣泛應(yīng)用于腫瘤和艾滋病的臨床治療1，2，但近來發(fā)現(xiàn)其治療效果并不如理論推測的那樣高。在一項283例的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和腎細(xì)胞癌的臨床研究中發(fā)現(xiàn)IL2的治療有效率只有15%-20%，其中長期有效率只有7

19、%3，而且在艾滋病的治療中部分患者應(yīng)用IL2后反而產(chǎn)生免疫抑制的現(xiàn)象4。另外，IL2對移植物抗宿主?。℅VHD）的影響是加重還是抑制一直存在爭議，目前普遍認(rèn)為，IL2對GVHD主要起促進(jìn)作用，但有些研究也發(fā)現(xiàn)IL2在一定條件下具有抑制GVHD的作用10，11，具體機(jī)制尚不清楚。IL2的功能具有多樣性, 不僅能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖和參與T細(xì)胞凋亡，而且還具有抑制免疫的作用，有研究認(rèn)為可能與Treg細(xì)胞有關(guān)5，12。本研究發(fā)現(xiàn)，IL2在一定濃度下可以抑制T細(xì)胞抗原特異性免疫應(yīng)答，其機(jī)理可能部分與誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)上調(diào)有關(guān)，目前還未見文獻(xiàn)報道。Yu等9曾用轉(zhuǎn)染方法使D10.G4.1 Th2 細(xì)胞高表達(dá)S

20、OCS3，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞抗原特異性免疫應(yīng)答明顯受抑。本研究用IL2誘導(dǎo)的方法使靜息DO11.10 T細(xì)胞SOCS3表達(dá)上調(diào)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的抗原特異性免疫應(yīng)答也明顯減弱。因此，我們認(rèn)為IL2抑制抗原特異性免疫應(yīng)答的作用機(jī)理可能部分與誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。SOCS3是JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路的抑制因子，可以通過抑制JAK激酶活性和STAT磷酸化兩種機(jī)制抑制細(xì)胞因子信號傳導(dǎo),阻止T細(xì)胞的免疫擴(kuò)大，產(chǎn)生免疫抑制作用13。因此，IL2在一定濃度下的抑制免疫作用可能與誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)上調(diào)有關(guān)，這一結(jié)果不僅有助于我們理解IL2功能的多樣性，還有助于解釋IL2在臨床治療時出現(xiàn)的免疫抑制現(xiàn)象。IL2的臨

21、床治療效果可能在很大程度上與機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)有關(guān)。如果應(yīng)用IL2的時候體內(nèi)T細(xì)胞已被抗原活化，由于活化T細(xì)胞高表達(dá)CD25，因此IL2與IL2R親和力明顯增強(qiáng)，激活JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路，同時T細(xì)胞經(jīng)抗原活化后SOCS3表達(dá)下調(diào)（圖3），使SOCS3對JAK/STAT通路的抑制作用減弱，最終STAT發(fā)生磷酸化進(jìn)入胞核內(nèi)，激活基因轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)大免疫反應(yīng)。體內(nèi)未接受抗原活化的靜息細(xì)胞不表達(dá)CD25，當(dāng)應(yīng)用外源IL2時，IL2與IL2R親合力低，JAK/STAT通路的細(xì)胞因子結(jié)合信號很弱，這時IL2可誘導(dǎo)負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子SOCS3的表達(dá)上調(diào)（圖2），使JAK/STAT通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)一步受抑，最終

22、抑制STAT轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入胞核內(nèi)，抑制免疫反應(yīng)，此時臨床用IL2治療腫瘤及艾滋病表現(xiàn)為無效甚至產(chǎn)生抑制免疫的現(xiàn)象。IL2在一定濃度下抑制免疫的作用與其上調(diào)SOCS3表達(dá)有關(guān)這一點具有重要的臨床意義，為IL2的臨床治療應(yīng)用提供參考作用。如果應(yīng)用IL2治療時機(jī)體免疫細(xì)胞處于激活狀態(tài)，必會擴(kuò)大免疫應(yīng)答；而如果應(yīng)用IL2治療時機(jī)體免疫細(xì)胞處于無能或未活化狀態(tài)，則很可能出現(xiàn)抑制免疫的現(xiàn)象，這也提示我們并非各種腫瘤疾病的各個時期都適合用IL2進(jìn)行治療，具體運(yùn)用的機(jī)制等還需進(jìn)一步研究解決。盡管IL2的作用機(jī)制已有較多研究，但仍存有許多疑點和爭議，了解其功能的多樣性，闡明其具體作用機(jī)制及調(diào)節(jié)作用，這可能是今后研

23、究的重點，而研究的不斷進(jìn)步也必將為其在臨床治療的應(yīng)用發(fā)展提供新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Atkins MB. Interleukin2: clinical applications. Semin Oncol, 2002; 29（Suppl 7）:12-172Kovacs JA, Vogel S, Albert JM, et al. Controlled trial of interleukin2 infusions in patients infected with the human immunodeficiency virus. N Engl J Med, 1996; 335:1350-135

24、63Rosenberg SA, Yang JC, Topalian SL, et al. Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using highdose bolus interleukin 2. JAMA, 1994; 271:907-9134Sereti I, Anthony KB, MartinezWilson H, et al. IL2 induced CD4+ Tcell expansion in HIV infected patients is ass

25、ociated with longterm decreases in Tcell proliferation. Blood, 2004; 104:775-7805Malek TR, Bayer AL.Tolerance, not immunity, crucially depends on IL2. Nat Rev Immunol, 2004; 4:665-6746Cohney SJ, Sanden D, Cacalano NA, et al. SOCS3 Is tyrosine phosphorylated in response to interleukin2 and suppresses STAT5 phosphorylation and lymphocyte proliferation. Mol Cell Biol, 1999, 19:4980-49887Alexander WS. Suppressors of cytokine signaling (SOCS) in the immune system. Nat Rev Immunol, 2002; 2:410-4168Jo D, Liu D, Yao S, et al. Intracellular protein therapy with SOCS3 inhibits inflammation and