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文檔簡介
1、白介素2抑制T細胞特異性免疫應(yīng)答機制的研究 作者:張騰龍,謝彥暉,王纓,林果為【摘要】 本研究查明白介素2(IL2)對靜息T細胞抗原特異性免疫應(yīng)答的作用,探討IL2對靜息T細胞中細胞因子信號傳導抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3 )表達的影響,及其與抗原特異性免疫應(yīng)答的關(guān)系。用IL2(50 U/ml)預(yù)處理靜息DO11.10 T細胞,洗滌去除IL2后用3HTdR摻入法檢測靜息DO11.10 T細胞針對OVA323-329抗原(ovalbumin,OVA,卵清蛋白)的特異性增殖;用I
2、L2(50 U/ml)刺激靜息DO11.10 T細胞,然后用熒光實時定量PCR法檢測SOCS3在刺激后不同時間的表達變化;用OVA323-329抗原活化靜息DO11.10 T細胞,然后檢測SOCS3在抗原活化后不同時間的表達變化。結(jié)果表明:靜息DO11.10 T細胞經(jīng)IL2刺激后抗原特異性增殖能力減弱;靜息DO11.10 T細胞經(jīng)IL2刺激后SOCS3表達上調(diào),在刺激4小時后表達即明顯上調(diào),6小時后達到最高峰;靜息DO11.10 T細胞經(jīng)OVA323-329抗原活化后SOCS3表達明顯下調(diào),在活化后第2天降至最低,4天后基本恢復正常。結(jié)論: IL2在一定條件下可抑制靜息T細胞抗原特異性免疫應(yīng)答
3、,而且這種抑制作用可能與SOCS3表達上調(diào)有關(guān)?!娟P(guān)鍵詞】 IL2;DO11.10 T細胞;SOCS3;OVA323-329抗原Abstract The study was aimed to investigate the effect of IL2 on the acquired immune response of naive T cells,and to explore the influence of IL2 on suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) express
4、ion of naive T cells, as well as to elucidate the role of SOCS3 on antigen specific immune response in vitro. Naive DO11.10 T cells were prestimulated with IL2 (50 U/ml), and stimulated with OVA323-329 antigen after removing IL2, then the proliferation of naive DO11.10 T cells was detected. Na
5、ive DO11.10 T cells were stimulated with IL2 (50 U/ml), and SOCS3 expression was detected by realtime PCR. Naive DO11.10 T cells were stimulated with OVA323-329 antigen, and SOCS3 expression was detected by means of 3HTdR. The results showed that after IL2 prestimulation, the proli
6、feration of naive DO11.10 T cells decreased significantly when stimulated with OVA323-329 antigen; SOCS3 expression of naive DO11.10 T cells was upregulated significantly after IL2 stimulation, the upregulation began obviously at 4 hours and reached peak at 6 hours. SOCS3 expression on naive DO11.10
7、 T cells was downregulated markedly after OVA323-329 antigen stimulation, the expression level of SOCS3 was lowest on day 2 and returned to normal on day 4 after stimulation. It is concluded that the antigen specific immune response of naive DO11.10 T cells is inhibited after prest
8、imulation with IL2, which may be mediated by SOCS3.Key words IL2; DO11.10 T cell; SOCS3; OVA323-329 antigen白介素2(interleukin2, IL2)作為一種免疫增強制劑被廣泛應(yīng)用于腫瘤和艾滋病的臨床治療1,2,但只有大約20%的患者有治療效果3,而且在某些治療中應(yīng)用IL2后反而產(chǎn)生免疫抑制的現(xiàn)象4,其具體機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn),IL2除能擴大免疫反應(yīng)外,還可誘導免疫耐受,認為這一作用可能與調(diào)節(jié)T細胞(Treg細
9、胞)有關(guān)5。另外還有研究發(fā)現(xiàn),在一定條件下IL2刺激T細胞可以誘導細胞因子信號傳導抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)表達上調(diào)6,而SOCS3是機體免疫應(yīng)答的抑制因子7。因此,IL2可能通過誘導SOCS3的表達來抑制T細胞對抗原的應(yīng)答。 為此, 我們以小鼠抗原特異性T細胞 (DO11. 10 T細胞)為研究對象,研究IL2對T細胞抗原特異性應(yīng)答的影響,同時研究T細胞免疫應(yīng)答與SOCS3變化的相關(guān)性。主要試劑與儀器TRIzoL購自北京鼎國生物公司,小鼠IL2為Sigma公司產(chǎn)品,realtime PCR Master Mix為Toyobo公
10、司產(chǎn)品,逆轉(zhuǎn)錄試劑與dNTP購自MBI公司,絲裂霉素為日本Kyowa公司產(chǎn)品,Taq DNA聚和酶購自Tiangen公司,所有引物均由上海生工生物公司合成。SN6904液體閃爍計數(shù)儀由上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠生產(chǎn),LightCyclerTM定量PCR儀為Roche公司產(chǎn)品,PE 240型PCR儀為Perkin Elmer公司產(chǎn)品。動物DO11.10 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠為卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)抗原特異性小鼠,均為SPF級,雌性,6-8周齡,15-20 g,由中國科學院上海動物中心飼養(yǎng)。靜息DO11.10 T細胞(naive DO11.10 T cell)的IL2預(yù)處理頸椎脫臼法
11、處死DO11.10 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠,用尼龍毛柱分離DO11.10 T細胞,以RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度,鋪入24孔板中,每孔1×107/2 ml,然后加入濃度為50 U/ml的IL26,于37、5 C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SOCS3基因的檢測總RNA提取與cDNA制備 用IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細胞后每2小時裂解細胞(0、2、4、6、8、10、12小時),按照TRIzoL reagent操作說明抽提總RNA,溶解于10 l DEPC水中。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以O(shè)ligodT為引物,操作按MBI試劑說明書進行。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
12、 此制備的cDNA為模板,操作按Taq DNA聚和酶操作說明進行,SOCS3引物上游序列為:5TGCGCCATGGTCACCCACAGC AAGTTT3,下游:5GCTCCTTAAAGTGGAGCA TCATACTGA3。熒光實時定量PCR(real timePCR)以上法制備的cDNA為模板,按realtime PCR Master Mix說明書進行操作,SOCS3引物上游為:5CAAGTCATCACTATTGGCAACGA3,下游:5CC CAAGAAGGAAGGCTGGA3。actin引物上游:5CCAGCCATGTACGTTGCTATC3,下游: 5CA GGTCCAGAC
13、GCAGGATGGC3。DO11.10 T細胞抗原特異性增殖實驗首先將分離的靜息T細胞在含有IL2(50 U/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)液中預(yù)處理6小時,洗滌去除IL2后加入96孔板中(1×105/well)。以絲裂霉素(100 g/ml)滅活的DO11.10 TCR轉(zhuǎn)基因小鼠脾細胞作抗原呈遞細胞(4×105/well)。OVA323-329特異性抗原終濃度為0.6 mol/L。37、5 CO2培養(yǎng)5天,終止培養(yǎng)前18小時加3HTdR (0.5 Ciwell),用液閃計數(shù)儀測cpm值。本實驗設(shè)3個復孔,設(shè)未經(jīng)IL2預(yù)處理的靜息DO11.10 T細胞組為對照組。統(tǒng)計學分析
14、采用SPSS 13.0軟件處理,用單因素方差分析(oneway ANOVA)統(tǒng)計方法分析數(shù)據(jù),P<0.01為有統(tǒng)計學意義。結(jié) 果IL2體外抑制靜息T細胞抗原特異性增殖IL2的所有作用都是通過與IL2受體(IL2R)結(jié)合來實現(xiàn)的。免疫應(yīng)答中,T細胞經(jīng)抗原活化后高表達CD25(IL2R亞基),此時IL2作用于T細胞,能夠與CD25結(jié)合促進T細胞增殖,增強免疫反應(yīng)。而T細胞未接受抗原活化前(靜息T細胞)基本不表達CD255,因此用IL2刺激靜息T細胞并不會促其增殖,但IL2對靜息T細胞的影響尚不清楚。本研究以DO11.10轉(zhuǎn)基因小鼠靜息T細胞(靜息DO11.
15、10 T細胞,為OVA抗原特異性T細胞)作為研究對象。靜息DO11.10 T細胞經(jīng)尼龍毛柱法分離后用FACS鑒定純度可達90以上,在接受抗原特異性活化之前先用IL2預(yù)處理6小時,然后再用OVA323-329抗原刺激,最后用3HTdR摻入法檢測其針對OVA323-329抗原的特異性增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)IL2預(yù)處理6小時的靜息DO11.10 T細胞的抗原特異性增殖較之正常對照組(靜息DO11.10 T細胞未經(jīng)IL2預(yù)處理組)明顯下降(P<0.01)(圖1)。IL2預(yù)處理靜息T細胞可以誘導SOCS3表達上調(diào)由前面得知,IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細胞可以抑制其抗原特異性增殖,而未經(jīng)IL2預(yù)
16、處理的靜息DO11.10 T細胞的抗原特異性增殖未受抑制,導致這種差異的原因就在于T細胞在接受OVA323-329抗原刺激前是否經(jīng)過IL2的預(yù)處理。Cohney等6研究發(fā)現(xiàn),IL2刺激T細胞可以誘導JAK/STAT信號傳導通路的反饋抑制分子(SOCS3)蛋白的表達上調(diào),因此我們進一步檢測在IL2預(yù)處理的過程中是否伴有SOCS3表達水平的變化。realtime PCR法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細胞的過程中SOCS3的表達水平明顯改變(圖2)。在靜息T細胞經(jīng)抗原活化后SOCS3表達下調(diào)由前面得知,IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細胞可以抑制其抗原特異性增殖,同時伴有SO
17、CS3表達上調(diào),因此我們進一步探討其具體作用機制,研究SOCS3在T細胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著怎樣的作用。我們用OVA323-329抗原活化靜息DO11.10 T細胞,研究在正常免疫應(yīng)答狀態(tài)下抗原特異性活化對T細胞SOCS3表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DO11.10 T細胞經(jīng)OVA323-329抗原活化后SOCS3表達水平明顯下調(diào)(圖3),在OVA323-329抗原活化后第1天即有明顯的下調(diào),活化后第2天降至最低,第3天開始逐漸升高直至第4天基本正常。由于SOCS3在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的負向調(diào)節(jié)作用8,因此抗原活化后SOCS3的短暫下調(diào)與機體的免疫防御有關(guān),有利于免疫應(yīng)答的迅速啟動,清除“異物”威脅,在
18、抗原活化后期恢復正常則與免疫自穩(wěn)有關(guān),可以防止免疫過度擴大造成損傷9。因此IL2預(yù)處理靜息DO11.10 T細胞可以誘導SOCS3表達上調(diào),使該T細胞在隨后的免疫應(yīng)答中不能將SOCS3下調(diào)至不影響免疫應(yīng)答啟動的水平,導致免疫應(yīng)答正常啟動受到影響,最終抑制該T細胞抗原特異性免疫應(yīng)答。討 論IL2是一種具有多種生物學活性的細胞因子,是增強機體細胞免疫的重要介質(zhì),目前被廣泛應(yīng)用于腫瘤和艾滋病的臨床治療1,2,但近來發(fā)現(xiàn)其治療效果并不如理論推測的那樣高。在一項283例的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和腎細胞癌的臨床研究中發(fā)現(xiàn)IL2的治療有效率只有15%-20%,其中長期有效率只有7
19、%3,而且在艾滋病的治療中部分患者應(yīng)用IL2后反而產(chǎn)生免疫抑制的現(xiàn)象4。另外,IL2對移植物抗宿主?。℅VHD)的影響是加重還是抑制一直存在爭議,目前普遍認為,IL2對GVHD主要起促進作用,但有些研究也發(fā)現(xiàn)IL2在一定條件下具有抑制GVHD的作用10,11,具體機制尚不清楚。IL2的功能具有多樣性, 不僅能夠促進T細胞增殖和參與T細胞凋亡,而且還具有抑制免疫的作用,有研究認為可能與Treg細胞有關(guān)5,12。本研究發(fā)現(xiàn),IL2在一定濃度下可以抑制T細胞抗原特異性免疫應(yīng)答,其機理可能部分與誘導SOCS3表達上調(diào)有關(guān),目前還未見文獻報道。Yu等9曾用轉(zhuǎn)染方法使D10.G4.1 Th2 細胞高表達S
20、OCS3,發(fā)現(xiàn)該細胞抗原特異性免疫應(yīng)答明顯受抑。本研究用IL2誘導的方法使靜息DO11.10 T細胞SOCS3表達上調(diào),發(fā)現(xiàn)該細胞的抗原特異性免疫應(yīng)答也明顯減弱。因此,我們認為IL2抑制抗原特異性免疫應(yīng)答的作用機理可能部分與誘導SOCS3的表達上調(diào)有關(guān)。SOCS3是JAK/STAT信號傳導通路的抑制因子,可以通過抑制JAK激酶活性和STAT磷酸化兩種機制抑制細胞因子信號傳導,阻止T細胞的免疫擴大,產(chǎn)生免疫抑制作用13。因此,IL2在一定濃度下的抑制免疫作用可能與誘導SOCS3表達上調(diào)有關(guān),這一結(jié)果不僅有助于我們理解IL2功能的多樣性,還有助于解釋IL2在臨床治療時出現(xiàn)的免疫抑制現(xiàn)象。IL2的臨
21、床治療效果可能在很大程度上與機體的免疫應(yīng)答狀態(tài)有關(guān)。如果應(yīng)用IL2的時候體內(nèi)T細胞已被抗原活化,由于活化T細胞高表達CD25,因此IL2與IL2R親和力明顯增強,激活JAK/STAT信號傳導通路,同時T細胞經(jīng)抗原活化后SOCS3表達下調(diào)(圖3),使SOCS3對JAK/STAT通路的抑制作用減弱,最終STAT發(fā)生磷酸化進入胞核內(nèi),激活基因轉(zhuǎn)錄,擴大免疫反應(yīng)。體內(nèi)未接受抗原活化的靜息細胞不表達CD25,當應(yīng)用外源IL2時,IL2與IL2R親合力低,JAK/STAT通路的細胞因子結(jié)合信號很弱,這時IL2可誘導負反饋調(diào)節(jié)因子SOCS3的表達上調(diào)(圖2),使JAK/STAT通路的信號轉(zhuǎn)導進一步受抑,最終
22、抑制STAT轉(zhuǎn)錄因子進入胞核內(nèi),抑制免疫反應(yīng),此時臨床用IL2治療腫瘤及艾滋病表現(xiàn)為無效甚至產(chǎn)生抑制免疫的現(xiàn)象。IL2在一定濃度下抑制免疫的作用與其上調(diào)SOCS3表達有關(guān)這一點具有重要的臨床意義,為IL2的臨床治療應(yīng)用提供參考作用。如果應(yīng)用IL2治療時機體免疫細胞處于激活狀態(tài),必會擴大免疫應(yīng)答;而如果應(yīng)用IL2治療時機體免疫細胞處于無能或未活化狀態(tài),則很可能出現(xiàn)抑制免疫的現(xiàn)象,這也提示我們并非各種腫瘤疾病的各個時期都適合用IL2進行治療,具體運用的機制等還需進一步研究解決。盡管IL2的作用機制已有較多研究,但仍存有許多疑點和爭議,了解其功能的多樣性,闡明其具體作用機制及調(diào)節(jié)作用,這可能是今后研
23、究的重點,而研究的不斷進步也必將為其在臨床治療的應(yīng)用發(fā)展提供新的思路?!緟⒖嘉墨I】1Atkins MB. Interleukin2: clinical applications. Semin Oncol, 2002; 29(Suppl 7):12-172Kovacs JA, Vogel S, Albert JM, et al. Controlled trial of interleukin2 infusions in patients infected with the human immunodeficiency virus. N Engl J Med, 1996; 335:1350-135
24、63Rosenberg SA, Yang JC, Topalian SL, et al. Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using highdose bolus interleukin 2. JAMA, 1994; 271:907-9134Sereti I, Anthony KB, MartinezWilson H, et al. IL2 induced CD4+ Tcell expansion in HIV infected patients is ass
25、ociated with longterm decreases in Tcell proliferation. Blood, 2004; 104:775-7805Malek TR, Bayer AL.Tolerance, not immunity, crucially depends on IL2. Nat Rev Immunol, 2004; 4:665-6746Cohney SJ, Sanden D, Cacalano NA, et al. SOCS3 Is tyrosine phosphorylated in response to interleukin2 and suppresses STAT5 phosphorylation and lymphocyte proliferation. Mol Cell Biol, 1999, 19:4980-49887Alexander WS. Suppressors of cytokine signaling (SOCS) in the immune system. Nat Rev Immunol, 2002; 2:410-4168Jo D, Liu D, Yao S, et al. Intracellular protein therapy with SOCS3 inhibits inflammation and
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