硫酸鎳致大鼠睪丸細(xì)胞線粒體及微粒體損傷(1)

1、硫酸鎳致大鼠睪丸細(xì)胞線粒體及微粒體損傷(1)    【關(guān)鍵詞】 硫酸鎳；睪丸；線粒體；微粒體；氧化應(yīng)激摘要： 目的 從氧化應(yīng)激角度探討硫酸鎳(NiSO4)對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞線粒體及微粒體的毒性作用。方法 健康性成熟Wistar雄性大鼠32只，隨機(jī)分為4組：生理鹽水(NS)組，硫酸鎳(NiSO4)125，250，500mg/kg組，等容積腹腔注射染毒，1次/d，連續(xù)30d。制備睪丸組織勻漿，離心提取線粒體和微粒體，采用分光光度法檢測(cè)睪丸細(xì)胞線粒體及微粒體中脂質(zhì)過氧化物(LPO)、總抗氧化能力(TAOC)、活性氧(ROS)水平的變化。結(jié)果 染毒組與對(duì)照組比較，大

2、鼠睪丸臟器系數(shù)無明顯變化(P005)。鎳可引起睪丸組織中LPO、ROS含量升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)；各染毒組TTOC均低于對(duì)照組(P<005)。結(jié)論 鎳對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞的損傷可能與其所致的睪丸細(xì)胞線粒體及微粒體氧化應(yīng)激效應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。關(guān)鍵詞： 硫酸鎳；睪丸；線粒體；微粒體；氧化應(yīng)激Oxidative damage of mitochondria and micriosome in testis cells induced by nickel sulfate in rats Abstract： Objective To explore the mitochondria a

3、nd microsome of testis cells caused by nickel sulfate in rate.Methods Thirtytwo male Wistar rats with sexual maturation were divided into four groups randomly,and three groups of rats were administrated intraperitoneally with nickel sulfate daily at doses 125,250，500 mg/kg respectively for 30 days,b

4、ut the control group was administrated with saline in same volume according to the rats'weight.The mitochondria and microsome of testis cells were prepared by centrifugation technique to detect the levels of lipid peroxidation (LPO),total antioxide capacity (T-AOC),reactive oxygen species (ROS)

5、in spectrophotometry.Results The organ coefficient of testis exposed to NiSO4 had no change compared wth the control group(P005).The LPO and ROS contents in testis of exposure groups were higher than that of control group(P005),but the T-AOC levels of the exposure groups were decreased compared with

6、 the control group(P001).Conclusion The rat's testis damage is related to the enhancement of oxidative stress of mitochondria and microsome caused by nickel sulfate.Key words： nickel sulfate;testis;mitochondria;microcome;oxidative stress    鎳是機(jī)體生命活動(dòng)所必需的微量元素，其生物學(xué)作用極為廣泛，但其化合物又是

7、當(dāng)前主要的職業(yè)危害因素和環(huán)境污染物之一。過量鎳的攝入可造成機(jī)體多系統(tǒng)、多器官損傷，同時(shí)也是一種比較明確的致癌劑2，3。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大劑量的鎳及其化合物對(duì)雄性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生殖功能具有毒性損害作用，鎳可透過血-睪屏障，蓄積在睪丸組織中4，引起睪丸生精代謝障礙，精子生成減少，形態(tài)發(fā)生改變，畸形率升高5，并可引起雄性大鼠性激素水平的改變6。研究發(fā)現(xiàn)，鎳可致大鼠血清、肌肉、肝臟和腎臟中脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量升高，并引起抗氧化酶活性的改變7，8。因此，本文從線粒體和微粒體的氧化損傷角度探索鎳對(duì)睪丸生殖細(xì)胞損傷的機(jī)制，為鎳致雄性生殖毒性的防治提供理論依據(jù)。1 材料與方法11 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar雄性

8、大鼠，體重180220 g(蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。12 試劑和儀器 硫酸鎳(NiSO4)，分析純(西安化學(xué)試劑廠)。脂質(zhì)過氧化物(LPO)、總抗氧化能力(TAOC)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。Dptima XL100K型高速冷凍離心機(jī)(美國Meckman公司)。722型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。SHAB型水浴恒溫振蕩器(常州國華儀器廠)。13 方法131 劑量選擇與分組 健康Wistar雄性大鼠32只，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(NS)，硫酸鎳125，250，50mg/kg組。連續(xù)腹腔注射染毒30d，1次/d，自由攝食飲水。132 樣品制備 (1)組織勻漿

9、的制備：染毒結(jié)束次日，頸椎脫位法處死大鼠，迅速摘取雙側(cè)睪丸，稱重后取雙側(cè)睪丸，去包膜，放入表面皿中剪碎，加入勻漿介質(zhì)(001mol/L Tris-HCl緩沖液，pH74)，用玻璃勻漿器制成10%(w/v)的睪丸組織勻漿。(2)線粒體的制備：取10%的組織勻漿，用低溫冷凍離心機(jī)1 500r/min離心10min，棄沉淀，上清液再重復(fù)離心1次，棄沉淀，留取上清液用低溫高速冷凍離心機(jī)12000r/min離心15min，沉淀物即為線粒體。(3)微粒體的制備：取分離線粒體后的上清液，用高速冷凍離心機(jī)40000r/min離心30min，沉淀物即為微粒體。將分離提取的線粒體和微粒體分別用冰冷的勻漿介質(zhì)制備成

10、混懸液，超聲破膜后待用。133 指標(biāo)檢測(cè) 每個(gè)樣品檢測(cè)2個(gè)平行樣，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測(cè)定睪丸細(xì)胞線粒體和微粒體中LPO、TAOC、ROS的水平。14 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 100軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行兩兩比較。2 結(jié)果21 染毒動(dòng)物的一般狀況和睪丸臟器系數(shù)的變化(表1) 染毒早期動(dòng)物出現(xiàn)輕微的興奮表現(xiàn)，染毒中期有精神萎靡，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)蓬松，拖尾等現(xiàn)象，染毒后期個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉癥狀，至染毒結(jié)束時(shí)未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡情況。睪丸大體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，硫酸鎳25 mg/kg組大鼠睪丸組織出現(xiàn)充血、水腫等現(xiàn)象，臟器系數(shù)略大于其他各組(P005)。50 mg/kg組睪丸臟器系數(shù)降低，與NS組比較，差異

11、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)。表1 NiSO4對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞線粒體中LPO、TAOC、ROS的影響（略）注：與對(duì)照組比較，a P005，b P001；n=8    由表1可見，與對(duì)照組比較，染毒組大鼠睪丸細(xì)胞線粒體中T-AOC降低(P001)，LPO和ROS含量升高(P005)。22 NiSO4對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞微粒體中LPO、T-AOC、ROS的影響(表2)表2 NiSO4對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞微粒體中LPO、T-AOC、ROS的影響（略）注：與對(duì)照組比較,a P005，b P001;n=8由表2可見，染毒組大鼠睪丸細(xì)胞微粒體中T-AOC降低(P<0.01)，LPO和ROS含量升高(P<0.05)。3 討論    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸鎳腹腔注射染毒后，大鼠睪丸細(xì)胞線粒體的氧化應(yīng)激效應(yīng)增強(qiáng)，提示此時(shí)線粒體產(chǎn)生過量ROS，引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化生成大量的LPO，同時(shí)抑制T-AOC活性，引起線粒體內(nèi)膜跨膜電位的下降，導(dǎo)致線粒體膜通透性發(fā)生變化，甚至出現(xiàn)線粒體DNA的廣泛損傷9，進(jìn)一步引起睪丸生殖細(xì)胞的損傷。本文結(jié)果顯示，鎳可導(dǎo)致微粒體氧化應(yīng)激效應(yīng)增強(qiáng)，引起微粒體膜的損傷及其