光學(xué)顯微鏡的使用簡單染色及革蘭氏染色

1、光學(xué)顯微鏡的使用簡單染色及革蘭氏染色摘要顯微鏡的使用在我們學(xué)習(xí)微生物等課程中非常重要，歷史上顯微鏡的發(fā)明和顯微鏡的每一次創(chuàng)新都給人類的認(rèn)知帶來了飛躍式的發(fā)展；給人類的生活帶來了空前的拓展。在提倡科技創(chuàng)新的今天，顯微鏡的使用已經(jīng)成為我們的一項(xiàng)基本技 能。本次試驗(yàn)的主要目的是通過用油鏡觀察經(jīng)過復(fù)染色的細(xì)菌玻片，分辨細(xì)菌的 革蘭氏陰陽性。通過實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)光學(xué)顯微鏡油鏡的使用原理與方法、細(xì)菌的革蘭氏染色法及分類鑒定的原理。為了研究細(xì)菌的形態(tài)，微生物學(xué)家發(fā)明了對細(xì)菌的染色，用兩種以上的稱復(fù) 染，革蘭氏發(fā)明了復(fù)染色法；先后用兩種染色劑和媒染劑、脫色劑組合，由此而 命名為革蘭氏染色。革蘭氏染色不僅可以觀察細(xì)菌的

2、形態(tài)，同時(shí)將細(xì)菌分為兩大 類。一類是染色陽性菌是紫色，另一類染色陰性的是紅色。由于細(xì)菌的結(jié)構(gòu)上的 差異，形成了不同的染色效果。了解染色性能有助于臨床用藥和細(xì)菌的鑒定。 關(guān)鍵詞顯微鏡的使用(Use of Microscope 革蘭氏染色(Gram stain)復(fù)染(counterstain) 媒染(mordant dyeing)脫色(discoloration)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解顯微鏡的構(gòu)造及使用2、學(xué)習(xí)顯微鏡(特別是白色圈標(biāo)記的油鏡)的使用方法3、學(xué)習(xí)并掌握微生物制片及簡單染色的基本技術(shù)4、初步了解不同細(xì)菌的形態(tài)特征5、了解革蘭氏染色原理，并掌握其方法實(shí)驗(yàn)原理（一）、普通顯微鏡的基本原理1、

3、基本原理顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短 使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫 外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提 高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加 數(shù)值口徑，可以提高介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時(shí)折射率為1,而香柏油的折射率為1.51，和載片玻璃的折射率（1.52 ）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接 通過載片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物 鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。2、油鏡微生物學(xué)使用的顯微鏡的物

4、鏡通常有低倍鏡（10X）、高倍鏡（40X ）和油鏡 （100X）,油鏡是三者中放大倍數(shù)最大的，油鏡的焦距和工作距離最短，油鏡與 其他物鏡不同的是載玻片與物鏡之間隔的不是一層空氣（干燥系），而是一層油脂，稱為“油浸系”。利用油鏡的目的是增加顯微鏡的分辨力。（二）、簡單染色的原理利用單一染料對菌體進(jìn)行染色的方法稱為簡單染色。用于染色的物質(zhì)為一類苯 環(huán)上連著發(fā)色基團(tuán)或助色基團(tuán)的有機(jī)化合物。發(fā)色基團(tuán)賦予染料顏色特征，而助 色基團(tuán)使其形成鹽。只有發(fā)色基團(tuán)而無助色基團(tuán)的苯化合物（色原）即使有顏色 也不能用作染料，因?yàn)樗荒茈婋x，不能與酸或堿形成鹽，難以與細(xì)胞結(jié)合而染 色。常用的微生物染料都是鹽，分堿性染料

5、（美藍(lán) -亞甲藍(lán)，結(jié)晶紫，堿性復(fù)紅， 沙黃-番紅，孔雀綠）和酸性染料（酸性復(fù)紅，伊紅，剛果紅）。通常采用堿性染 料進(jìn)行簡單染色，因?yàn)槲⑸锛?xì)胞在堿性，中性及弱酸性的環(huán)境中多帶有負(fù)電荷， 而染料電離后染色部分帶正電性，易相互結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞處于酸性條件時(shí)（如分解 糖類產(chǎn)酸）所帶正電荷增加，可采用酸性染料染色。染色前必須固定細(xì)菌。其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。 常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。 固定時(shí) 盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。（三）、革蘭氏染色的基本原理革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法不僅能觀察到細(xì)

6、菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分 為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色 的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用 G+表示；染色反應(yīng)呈 紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用 G-表示。細(xì)菌對于革蘭氏染色的不 同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞 壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞而 不易脫色。因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含 量低，而脂類物質(zhì)含量高。當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增 加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色。然后又被染上了復(fù)染

7、液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料（basic dye）初染液；媒染劑（morda nt）;脫色劑（decoloriz ing age nt）禾口復(fù)染液（co un tersta in）。堿性染料初染液的作用像在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫（crystal violet） 。媒染劑的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細(xì)胞上，使不易脫落。碘（iodine）是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能 被脫色，有的則不能，脫色劑常用 95%的酒精（

8、ethanol）。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì)胞仍然保持初染的顏色，從而 將細(xì)胞區(qū)分成G+和G-兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。革蘭染色的意義：將細(xì)菌染成兩大類，即革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，可用于鑒別細(xì)菌；研究細(xì)菌的致病性，革蘭陽性菌可產(chǎn)生外毒素，革蘭陰性菌可產(chǎn)生毒 素；選擇敏感的抗生素，革蘭陽性菌可使用青霉素等作用于細(xì)胞壁的抗生素，革蘭陰性菌可使用紅霉素、鏈霉素等抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素。G+菌:細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性障，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖脫水而孔 障縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上。呈紫色。G-

9、菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高，乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，沙黃復(fù)染后呈紅色。三、實(shí)驗(yàn)器材1、 菌種：金黃色葡萄球菌（G乍、大腸桿菌（G-）、枯草芽孢桿菌以及自主選擇菌種2、溶液和試劑: 結(jié)晶紫、番紅等各種染料以及碘液、酒精等 香柏油、二甲苯等3、儀器及其它用品：普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、酒精燈、載玻片、接種針、培養(yǎng)皿等四、實(shí)驗(yàn)容（一）顯微鏡的構(gòu)造及其使用1、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)實(shí)物圖結(jié)構(gòu)圖現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡由機(jī)械系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成 機(jī)械系統(tǒng)主要包括：鏡座、鏡臂、載物臺、轉(zhuǎn)換器、調(diào)節(jié)裝置等組成。光學(xué)系統(tǒng)主要包括：物鏡、目鏡、聚光器、光源

10、等組成。2、顯微鏡的使用方法 安放右手握住鏡臂，左手托住鏡座，使鏡體保持直立。桌面要清潔、平穩(wěn)，要選擇臨窗或光線充足的地方。單筒的一般放在左側(cè)，距離桌邊34厘米處。 低倍鏡觀察先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動反光鏡，調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細(xì)調(diào)對準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀察。除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點(diǎn)。如果視野中出現(xiàn)外界物體的圖像，可以將聚光鏡 稍微下降，圖像就可以消失。聚光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮?，以控制?入光線的量，增加明暗差。 高倍鏡觀察顯微鏡的設(shè)計(jì)一般是共焦點(diǎn)的。低倍鏡對準(zhǔn)焦點(diǎn)后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡基本上也 對準(zhǔn)焦點(diǎn)，只要稍微轉(zhuǎn)動微調(diào)即可。有些簡易

11、的顯微鏡不是共焦點(diǎn)，或者是由于 物鏡的更換而達(dá)不到共焦點(diǎn)，就要采取將高倍物鏡下移，再向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法。 虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度。稍微上下移動聚光鏡，觀察圖像 是否清晰。 油浸鏡觀察油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時(shí)，一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。載玻 片標(biāo)本也可以不經(jīng)過低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動止降裝 置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微 調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。沒有自動止降裝置的，對準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀察， 將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止，然后用微

12、調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。使用油浸鏡時(shí)，鏡臺要保持水平，防止油流動。油浸鏡所用的油要潔凈，聚 光鏡要提高到最高點(diǎn)，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會降低數(shù)值口徑而影響分辨率。無論是油浸鏡或高倍鏡觀察，都宜用可調(diào)節(jié)的顯微鏡燈作光源。注：使用顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)應(yīng)用雙眼五、實(shí)驗(yàn)步驟1、 簡單染色流程圖：洗片T干燥T涂片T加熱干燥固定T染色液染色T水洗T干燥T鏡檢 涂片取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴生理鹽水，用接種環(huán)無菌操作將沾 有菌苔的接種環(huán)置于載玻片上的生理鹽水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可； 干燥自然干燥或用電吹風(fēng)吹干； 固定涂菌面朝上，通過火焰以固定菌物，注意溫度的控制，過熱的溫度會將細(xì)菌 殺死，溫

13、度以手背感覺微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)；通過火焰23次。 染色5min將載玻片平放于載波片支架上，滴加結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色1、 水洗（沖洗反面）傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來水沖洗，水流不宜太急、太大，至 洗出水無色為止； 干燥用吸水紙吸去多余水分，自然干燥或電吹風(fēng)吹干； 鏡檢將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察、記錄；2、 革蘭氏染色流程圖：洗片-干燥涂片-加熱干燥固定-結(jié)晶紫初染-水洗-碘液媒染水洗- 乙醇脫色t水洗t番紅復(fù)染t水洗t干燥t鏡檢 涂片：先在載玻片上滴一滴無菌水，再用接種環(huán)取少量菌體，涂在載玻片上，使 其薄而均勻。 晾干：讓涂片在空氣中自然干燥。 固定：讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。 染色：在固定過的涂片滴加草酸銨結(jié)晶紫液，染1.5min。 水洗：用水緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 脫色：吸去殘留水，連續(xù)滴加95%乙醇脫色30s至流出液無紫色，立即水洗。 復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染 1.5min，水洗。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌名稱菌體顏色細(xì)菌