人氫化可的松HYD酶聯(lián)免疫分析ELISA

1、人氫化可的松 (HYD)酶聯(lián)免疫分析（ ELISA）試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定人血清， 血漿及相關液體樣本中氫化可的松 (HYD)的含量。實驗原理：本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人氫化可的松 (HYD) 水平。用純化的人氫化可的松 (HYD) 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入氫化可的松(HYD) ，再與 HRP 標記的氫化可的松 (HYD)抗體結合，形成抗體-抗原 -酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣品中的氫化可的松(HYD) 呈

2、正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中人氫化可的松(HYD)濃度。試劑盒組成 ：試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存說明書1 份1 份封板膜2 片（ 48）2 片（ 96）密封袋1 個1 個酶標包被板1× 481× 962-8保存標準品： 2700ng/L0.5ml ×1 瓶0.5ml × 1 瓶2-8保存標準品稀釋液1.5ml × 1 瓶1.5ml × 1 瓶2-8保存酶標試劑3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存樣品稀釋液3 ml × 1 瓶6

3、 ml × 1 瓶2-8保存顯色劑 A液3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存顯色劑 B液3 ml × 1 瓶6 ml × 1 瓶2-8保存終止液3ml× 1 瓶6ml × 1 瓶2-8保存濃縮洗滌液（ 20ml× 20 倍）× 1 瓶（20ml ×30 倍）× 1 瓶2-8保存注意事項：1 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。2 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。3 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣

4、時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。5 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標準品孔第一孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計1算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n× 5）。6 底物請避光保存。7 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.8 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。9 本試劑不同批號組分不得混用。10. 如與英文說明書有異，以英

5、文說明書為準。樣本處理及要求 ：1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右 （ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后，離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。3. 尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20 分

6、鐘左右（ 2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4 ）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100 萬 /ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?2-8的溫度。加入一定量的 PBS（ PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用

7、。6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于 -20保存，但應避免反復凍融 .7. 不能檢測含 NaN3的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（ HRP）活性。操作步驟1.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測樣品10l（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。2.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標準品 100l，然后在第一、第二孔中加標

8、準品稀釋液50l，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100l 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50l，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50l 棄掉，再各取 50l 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul ，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50l 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50l，混勻后從第七、第八孔中分別取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50l，混勻后從第九第十孔中各取50l 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50l，濃度分別為 1800ng/L ， 1200ng/L ， 600

9、ng/L ， 300ng/L ， 150ng/L ）。3.溫育：用封板膜封板后置37溫育 30 分鐘。4.配液：將 30（ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（ 48T的 20 倍）倍稀釋后備用。5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。6.溫育：操作同3。27. 洗滌：操作同 5。8. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 l，再加入顯色劑 B50l，輕輕震蕩混勻， 37避光顯色15 分鐘.9. 加酶：每孔加入酶標試劑 50l，空白孔除外。10. 終止：每孔加終止液 50l，終止反應（此時藍色立轉黃色） 。11.測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進行。試劑盒性能：1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R 值為 0.95 以上。2.批內(nèi)與批見應分別小于9%和 11%計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD