結構生物學(電鏡,核磁共振,X射線衍射,質譜)

1、²第一，凡要發(fā)揮功能和活性的生物大分子必須具有特定的，自身特有，相對穩(wěn)定的三級結構;²第二，結構運動。任何的破壞促使沒有穩(wěn)定的三級結構和結構運動，生物大分子是很難發(fā)揮生物功能或活性的。結構生物學是通過確定生物大分子三級結構，來研 究生物大分子的結構功能關系，從而探討生物大 分子的作用機制和原理作為研究目的。 主要研究方法: ² X-射線晶體衍射方法（X-射線蛋白質晶體學） ² 多維核磁共振（ NMR ） ² 電鏡晶體學和電鏡三維重組方法 系，如二維的晶體和對稱性很高的三維²年代，多維核磁共振波譜學的發(fā)明使得在水溶研究生物大分子成為可能

2、,水溶液中的生物大分更接近于生理狀態(tài).²年代到本世紀初，冷凍電子顯微鏡的發(fā)明，這種明使我們不僅能夠研究生物大分子在晶體狀和溶液狀態(tài)的結構，而且能夠研究研究復雜的大分系超分子體系，這就是細胞器和細胞.見結構生物學的發(fā)展過程經歷了從結晶到溶液再到系，超分子體系，如核糖體(ribosome)、病體(lysosome)和線粒體等. ²年底,應用X 射晶衍射方法完成了核小體心顆粒分辨率為的精細空間結構定,每個核小體的盤心含有8個組蛋白形八面體、外繞146 基對組成的DNA ,這出的成就對了解基、DNA復制與修復態(tài)過程都很重要.,應用X 射線單晶衍射技術測定蛋白質和核酸并結合分子模擬技

3、術,已經為新藥物的供了一個全新的方向,大大縮短了新藥的研制過程. 的設計和開發(fā),要求對這些藥物靶標( drug 的結構、性能有精確的了解,由于迄今對了解甚少,現有臨床藥物絕大多數是通過嘗試篩選,導致研制一個新藥常常需十多年,甚至幾十間.過對愛滋病病毒(HIV) 蛋白酶精細結構測定,并以此為靶標酶的抑制劑作為治療愛滋病效藥物獲得巨大成功,已顯少愛滋病死亡數量.Questions?為什么要用X-射線?為什么要用衍射?什么是晶體，為什么要用蛋白質晶體進行衍射?如何根據衍射結果解析蛋白質結構?X-rayProteinCrystalX射線是波長在 100Å0.01Å之間的一種電磁輻射

4、 , 常用X射線波長約在2. 5Å0.5Å之間，與原子以及化學鍵的尺度相當，都在 Å的數量級。因此 可以被用來探測蛋白質分子內部的結構。 把透鏡換成X射線透鏡把光源換成X射線到目前為止人類還沒有發(fā)現什么方法能夠讓X-射線發(fā)生折射。所以當前只能通過衍射這種不那么直觀的方法來研究蛋白質分子內部構造。什么是晶體？NaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNa² 基本方程 ³ 勞厄定律 ³ 布拉格定律 一束X-射線f(x) = A cos(2x )來說，無論它的初始相角是多少，它在接收所形成的曝光點都是相同的。反之，我們

5、只根據接收屏上的曝光點也是無法得的X-射線的初始相角信息的。相角無法直接測量得到，但它又是求解電子密度時所必需的信息。這就是X-射晶體衍射法解析物質結構時所需要解決的核心問題相位（相角）問題。解決相位問題的方法：1.同晶置換法（MIR）：最原始的方法，包括多對同晶置換法和單對同晶置換法。需要在蛋白質晶體中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶體與未引入重原子的晶體的晶型基本相同。解析過程需要未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多顆晶體的多套衍射數據。2.反常散射法（AD）：包括多波長反常散射法（MAD）和單波長反常散射法（SAD）。通常需要引入具有較強反常散射能力的原子，如硒原子。

6、不需要多顆晶體但往往需要同一顆晶體在不同波長X-射線照射下的多套衍射數據。隨著技術的進步，目前蛋白質自身的硫原子也開始被用來作為反常散射源。3.分子置換法（MR）：需要同源性較高的蛋白質分子結構模型，不需要多顆晶體，不需要多套衍射數據，方便快捷，但不能用來解析全新的結構。4.直接法（Direct method）。這是未來的方法，對蛋白質來說仍處在向實際應用的發(fā)展階段。主要技術流程圖v蛋白質分子必須均一（純化）均一的蛋白質分子不均一（不純）的蛋白質分子沉淀沉淀劑濃度未飽和成核區(qū)過飽和區(qū)蛋白質濃度蛋白質分子體積大，分子表面情況復雜，性不明顯，分子間作用力弱等原因，蛋白質在達到過飽和的時候不容易有序

7、排列形成容易隨機聚合形成沉淀。因此需要對不同蛋白質篩選各自的結晶條件。晶技術：v整批結晶法v液液擴散法v透析法v氣相擴散法a. 懸滴法b. 座滴法1µl 蛋白溶液1µl 結晶溶液結晶溶液成分：v沉淀劑通常為不同分子量的聚乙二醇或者高濃度的硫酸銨、氯化鈉等。v輔助分子通常為低濃度的鹽vpH緩沖劑例如：HamptonResearchCrystalScreenKit#140.2MCaCl20.1MHEPESpH7.528%(v/v)PEG400Detergentsandadditives最初篩選得到的結晶條件往往不是該蛋白的最佳結晶條件。此時的蛋白質晶體往往衍射能力很差，甚至沒有

8、衍射。因此一般來說還需要對該蛋白質的結晶條件進行優(yōu)化。優(yōu)化前優(yōu)化的方法就是把結晶溶液中的沉淀劑、輔助分子，結晶時的蛋白質濃度在原濃度附近做一個梯度；相應地，結晶溶液中的pH值也要在原值附近做一個梯度。在把這些梯度排列組合起來，從而找出一個最佳的結晶條件。優(yōu)化后² ² ² ² ² X射線衍射數據的收集質量對于結構的解析至關重要。 一套高質量的數據往往會使隨后的結構解析工作達到事半功 倍的效果。 由于蛋白質晶體內部含有大量的溶劑，熱損傷和輻射損傷的 影響，室溫時蛋白質分子非常容易失去其三維結構。而且輻 射損傷使數據收集受到干擾，使得測量產生實驗誤差

9、。 早些時候，收集一套完整的數據需要幾顆甚至十幾顆晶體才 能完成，這需要數據套之間的良好整合，為結構解析帶來了 非常不利的影響。 快速冷卻至低溫（flash-cooling）收據數據的方法解決了這 個問題，同時這一技術也使捕捉存在時間很短的中間態(tài)成為 可能。 具體操作：1、使用晶體前，需要測試防凍液以確定玻璃化狀態(tài)的最小的濃度。先用一個mounting assembly（loop的尺寸要與晶體大小匹配），在母液中蘸一下后迅速放在有低溫氮氣流的X-射線衍射儀的測角頭上，在顯微鏡或屏幕上進行觀察，如果液滴變?yōu)椴煌该鳎ㄈ榘咨?，則說明單純的母液不能在低溫冷卻時使用，需要使用防凍劑。2、選擇不同的防凍

10、液和濃度直到被冷凍的溶液仍然澄清，則這個濃度的防凍液就是你所需要的低溫冷卻條件。隨后便可以用晶體進行測試了。選擇一顆合適的晶體，在所確定的防凍液中蘸一下迅速放在有低溫氮氣流的X-射線衍射儀的測角頭上，測試其衍射情況。由于晶體會與單純的母液對低溫冷卻的反應不同，因此還需要進行一系列的測試，以找到合適的條件，以使晶體在低溫氮氣中仍為透明的顏色。3、還可采用系列浸泡，透析和交聯(lián)等等方法得到衍射較好，且鑲嵌度小的晶體用于數據的收集。² 同步輻射的原理和裝置 接近光速運動的荷電粒子在磁場中改變運動 方向時放出的電磁輻射。它是1947年在 GE 公司 的 Schenectady 實驗室里發(fā)現的，

11、當時它被認為 是一種妨礙得到高能量粒子的“禍害”。1965 年 發(fā)明了儲存環(huán)，它由一系列二極磁鐵（使電子作 圓周軌道運動）、 四極磁鐵（使電子束聚焦）、 直線節(jié)和補充能量的高頻腔組成，可以把電子束 （或正電子束）儲存在環(huán)內長時期運行，于是在 每一個彎轉磁鐵處都會產生同步輻射，同步輻射 才開始走向實用。 ²在已解出的生物大分子結構數中，利用同步輻射技術解出的大于55%；每年解出物大分子晶體結構中，同步輻射解出的結構為60%100%；世界上現有同步輻射生物大分子實驗線站有50余個；生物大分子實驗線站在各國同步輻射實驗室中均占重要地位，用戶需求量大，成果比重大。而且通過對結構的動態(tài)研究可以

12、得出結構改變與功能實現方面的重要知識。而X射線單晶衍射方法也有缺點,就是樣品但生物大分子結晶困難，特別膜蛋白和病毒等分子組裝體結晶更是困難。次對于像病毒那樣大的分子組裝體，測量精細結構十分復雜. 原因有二：胞含有的原子極多，X射線衍射點極常常無法區(qū)分、辨認和探測；胞所產生的衍射點強度過弱，特別高分辨時，無法與背景區(qū)分。NMR也是測定生物大分子結構重要手段基本原理：核磁共振現象( nuclear magneticresonance spectroscopy ,NMR)1946 年由哈佛大學的伯塞( E.M.Purcell) 和斯坦福大學的布洛赫(F.Bloch) 所領導的2個小組,用不同的方法在

13、各自的實驗室里觀察到的,伯塞爾使用的實驗方法是吸收法,而布洛赫使用的是感應法.核磁共振分析技術是利用物理原理,通過對核磁共振譜線特征參數的測定來分析物質的分子結構與性質.NMR 不破壞被測樣品的內部結構,是一種無損檢測方法.由于不同的原子核吸收不同的電磁波,因而通過測定和分析受測物質對電磁波的吸收情況就可以判定它含有哪種原子,原子之間的距離有多大,并據此分析出它的三維結構。以蛋白質為例,它的二級結構如螺旋,折疊、轉角、環(huán)形和卷曲等,體現了蛋白分子主鏈原子在三維空間各種不同的排列規(guī)律性. 位于不同二級結構域的原子核間距,原子核間的相互作用以及多肽段的動特性,都直接反映蛋白質三維結構的特征.這些具

14、有不同結構特征的原子核間距、肽鍵二面角、肽鍵的動態(tài)特性等都具有特征的核磁共振譜線. 因此,我們分析核磁共振譜就可以獲得蛋白質的三維結構.1H,13C,15N是核磁共振檢測的主要對象,各不同的共振頻率,從而形成核磁共振氫譜、碳譜和氮譜三部分.最初,核磁共振技術主要用于核物理研究方面,用它測量各種原子核的磁矩,誤差僅是0. 003 %0. 005 %; 迄今,它已廣泛應用于化學、食品、醫(yī)學、生物學、遺傳學等學科領域,已成為在這些領域開展研究工作的有力工具,甚至是某些領域(如:化學、醫(yī)學診斷、藥物學等) 常規(guī)分析中不可缺少的手段。1985 年,維特里希( Kurt Wüthrich）等人公

15、布了第一次利用NMR 法測定的溶液中蛋白酶抑制劑IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的結構。1990 年用NMR 測定的蛋白質結構有23 個,而到1994 年一年測定的蛋白質結構數上升到100個。1997 年,維特里希應用NMR 方法測定的一種蛋白感染素(prion protein)的結構。²²核磁共振方法的最大特點是可以直接在溶液中定自然狀態(tài)下的大分子三維空間結構,其分辨率已接近012nm ,但因為大分子量的生物分子的核磁共振圖譜非常復雜,難以解釋,因此它只能測量分子量較小(15-25kDa)的生物分子,至今最大可測定35kDa 的生物分子;其

16、次在測定中要求樣品是高純度且數量相對較多,使樣品制備亦有困難;此外,核磁共振只能用于水溶液性的生物樣品,對膜蛋白或病毒等的組裝體、復合體就無法測定.²另一種方法稱為冷凍電鏡計算機三維重構方法或單顆粒技術. 這種技術特點是:急速冷凍(103 -104 Ps) 樣品懸液,樣品被包埋在無定形的非晶態(tài)冰薄膜中,這樣既不損傷樣品,又可使樣品保持著自然狀態(tài),因而樣品制備簡單,缺點是分辨率稍低. 利用這種技術研究的病毒樣品,目前分辨率接近0.17nm ,預計這幾年內可達0.14nm. 核糖體可達1.10nm ,而離子通道可達2.10nm.²²²由于應用冷凍電鏡與計算機重構技術研究維結構所需樣品制備簡單,對病毒的大小沒有使其發(fā)展很快,至今已有100 多個病毒的三維結構被冷凍電鏡計算機