制備型高速逆流色譜分離純化水線草中的強(qiáng)極性化合物

1、華章275二一一年第三期Magnificent Writing水線草(Hedyotis corymbosa (Linn.Lamarck 又名傘房花耳草是藥用全草1,其性平,味甘,有清熱解毒活血化瘀,截瘧功能,用于治療闌尾炎、瘡疥腫毒、燙傷、毒蛇咬傷、瘡積、咽喉炎、泌尿系感染,瘧疾、跌打癖痛、刀傷等,民間亦用于治療癌癥2。高速逆流色譜(High-speed Counter-current Chromatogra-phy ,HSCCC 是一種以液相作為固定相的新型液相色譜技術(shù),主要特點(diǎn)在于分離純化的所有溶劑和樣品都可完全回收,適合于制備分離,因此該技術(shù)被廣泛用于天然產(chǎn)物中有效成分的提取和中藥的分析

2、鑒定3-4。在現(xiàn)已知的研究中,高速逆流技術(shù)在弱極性化合物的分離和純化方面應(yīng)用較為廣泛;與前者相比,在強(qiáng)極性的分離純化方面相對較少。其主要原因是:強(qiáng)極性體系的選擇難度遠(yuǎn)大于弱極性體系的選擇。水線草的化學(xué)成分研究往往是通過硅膠,層析綜合純化方法;而本文是首次利用高速逆流,優(yōu)化強(qiáng)極性體系最終得到純度較高的強(qiáng)極性化合物。1、實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑。TBE-300高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司;Waters 公司分析型高效液相色譜(HPLC 儀;乙酸乙酯,乙醇,正丁醇均為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;水線草(Hedyotis corymbosa (Linn.Lamarck 購自于安徽

3、亳州藥材交易市場。1.2樣品準(zhǔn)備。水線草藥材經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,95%乙醇回流提取,合并提取液,減壓濃縮后得到浸膏。將浸膏適量的純凈水溶解,過濾,取上清液減壓蒸干得浸膏,取水線草上清液浸膏,用甲醇超聲溶解,過濾后得到的上清液經(jīng)D101型大孔樹脂以10%、30%、50%、70%、100%的甲醇梯度進(jìn)行洗脫,收集每段洗脫液減壓濃縮的浸膏,將50%梯度洗脫餾分浸膏作為供試品待用。1.3兩相溶劑體系及樣品溶液的制備。本實(shí)驗(yàn)中HSCCC 溶劑系統(tǒng)為正丁醇-乙酸乙酯-水(5:4:10,V/V ,按比例將四中溶液加入分液漏斗中,振蕩使溶液充分混合,待靜置平衡后分得上相(固定相和下相(流動相,分別超聲脫氣以備用。稱

4、取1.2節(jié)所備出的粗提物,溶于下相(流動相中,振蕩使之完全溶解,待用。1.4分配系數(shù)的測定。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)文獻(xiàn)5用HPLC 測量樣品在不同溶劑體系及比例中的分配系數(shù)。稱取適量(約1mg 水線草藥材的粗提物置于試管中,分別加入已達(dá)到平衡的上、下相溶劑各1mL ,振蕩使樣品充分溶解,靜置平衡,然后上下相各取0.2mL ,濃縮干燥后,用色譜級甲醇溶解稀釋到適當(dāng)濃度進(jìn)行HPLC 檢測,檢測結(jié)果上相中化合物峰面積為A1,下相中化合物峰面積為A2,分配系數(shù)K 為:K=A1/A2。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析篩選出了對于本實(shí)驗(yàn)中水線草粗提物的各組分整體分離效果較好、固定相保留率較高的體系。1.5HSCCC 分離過程。將已

5、超聲脫氣后的上相(固定相,以20mL /min 的速度泵入HSCCC 分離管中,待上相充滿整個管路,設(shè)定分離管順時針旋轉(zhuǎn),緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)至900r/min ,同時以1.5mL/min 流速注入下相,兩相達(dá)到平衡后由進(jìn)樣閥注入18mL 樣品溶液,同時采集數(shù)據(jù),通過紫外檢測器(254nm 檢測,按照色譜峰手動收集目標(biāo)餾分。2、結(jié)果與討論2.1HSCCC 溶劑系統(tǒng)選擇及實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化。一個適宜的溶劑系統(tǒng)對于高速逆流色譜分離樣品是十分關(guān)鍵的。在本實(shí)驗(yàn)中,共考察了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水,氯仿:甲醇:水,正丁醇-丙酮-水,正丁醇-乙酸乙酯-水等四個不同的主溶劑體系。在每個溶劑系統(tǒng)的分配系數(shù)通過HPLC

6、 測定發(fā)現(xiàn),正丁醇-乙酸乙酯-水(5:4:10,V/V 系統(tǒng)有較好的保留率,分離度以及峰型都很好,分離效果最優(yōu),因此選擇作為本實(shí)驗(yàn)的溶劑系統(tǒng)。此外,對影響分離效果的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化:轉(zhuǎn)速及流動相流速?？疾炝巳N轉(zhuǎn)速:750r/min ,800r/min ,900r/min 。發(fā)現(xiàn)隨著流速的提高,固定相的保留率有所增加,當(dāng)轉(zhuǎn)速為900r/min 時,獲得最佳分離效果,因此選擇流速為900r/min ;考察了兩種流速:2mL/min ,1.5mL/min 。發(fā)現(xiàn)隨著流速的提高,固定相的保留體積越少,當(dāng)流速為1.5mL/min 時。,獲得最佳分離效果。因此在此最佳分離條件下,固定相保留率為48

7、%。(圖1 2.2HPLC 檢測結(jié)果分析。利用HPLC 檢測HSCCC 收集餾分的純度,可知三種化合物純度分別為:90%、91%、94%。2.3討論。本實(shí)驗(yàn)首次采用制備型高速逆流色譜儀TBE-300對水線草的強(qiáng)極性化合物進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)過程中對溶劑系統(tǒng)和參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化,在最佳分離條件下,經(jīng)過一步分離獲得三個純度較高的化合物。相比于傳統(tǒng)的分離方法,高速逆流色譜進(jìn)樣量大,重復(fù)性好,加之其不需要任何固態(tài)載體,從而避免了不可逆吸附,使得樣品具有較高的回收率,很實(shí)用于微量物質(zhì)的分離制備?？傊?高速逆流色譜在天然產(chǎn)物的分離純化領(lǐng)域具備獨(dú)特的優(yōu)勢,前景良好,值得我們進(jìn)一步的研究探索?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】3張?zhí)煊?逆流色譜技術(shù)M .北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社,200l.171.4戴德舜,王義明,羅國安.高速逆流色譜研究進(jìn)展J .分析化學(xué),2001.29.摘要首次采用制備型高速逆流色譜儀TBE-300對水線草藥材中的強(qiáng)極性化合物進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)過程中對溶劑和參數(shù)條件進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化,獲得較好的分離條件。溶劑系統(tǒng):正丁醇-乙酸乙酯-水(5:4:10,V/V,上相(有機(jī)相為固定相,下相(水相為流動相,正相洗脫;進(jìn)樣濃度:12mg/mL;進(jìn)樣體積:20mL;留速900r/min。進(jìn)一步分離獲得三種高純度強(qiáng)極性類化合物,但結(jié)構(gòu)尚待確定。關(guān)鍵詞高速逆流色譜;水線草;分離純化中圖分類號TQ461文獻(xiàn)標(biāo)