再生障礙性貧血患者Fas抗原的表達(dá)及血漿可溶性Fas、FasL測(cè)定的臨床意義

1、    再生障礙性貧血患者Fas抗原的表達(dá) 及血漿可溶性Fas、FasL測(cè)定的臨床意義        【摘要】目的探討Fas(CD95)/FasL(CD95L)系統(tǒng)在再生障礙性貧血（再障）中的表達(dá)及臨床意義。方法用酶聯(lián)免疫夾心法檢測(cè)32例再障患者血漿可溶性Fas、FasL（sFas、sFasL），用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓CD34+細(xì)胞、CD34-細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMNCs）Fas抗原的表達(dá)。結(jié)果再障患者骨髓CD34+細(xì)胞Fas表達(dá)率顯著高于正常對(duì)照（P<

2、0.05），且重型再障組較慢性再障組顯著增高（P<0.05），重型再障和慢性再障CD34細(xì)胞Fas表達(dá)均與病程呈負(fù)相關(guān)；再障患者血漿sFas顯著低于正常對(duì)照（P<0.05），重型再障較慢性再障顯著降低（P<0.05），血漿sFas與CD34+細(xì)胞Fas表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論Fas/FasL系統(tǒng)表達(dá)異常與再障的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。【關(guān)鍵詞】貧血，再生障礙性；抗原，CD95；配體 The expression of Fas antigen and plasma levels of sFas and sFasL in patients with aplastic anemiaREN Cu

3、iai, ZHANG Maohong, XU Conggao, et al. The Affiliated Hospital of Shandong Medical University, Jinan250012，China【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of Fas/FasL system in the pathogenesis of aplastic anemia (AA) and its correlation with clinical status. MethodsPlasma levels of sFas and sFasL a

4、nd the expression of Fas antigen on mononuclear cell (MNC) membrane in 32 AA patients and 24 normal controls were assayed by ELISA and FACS,respectively. ResultsThe percentage of CD34+Fas+ cells was significantly higher(P<0.05) in AA patients than that in normal controls，and the percentage of CD3

5、4+Fas+ cells in severe AA patients was much higher than that in chronic AA patients(P<0.05). The percentage of CD34+Fas+ cells was negatively correlated with the course of disease. The levels of sFas were significantly lower (P<0.05) in AA patients than that in normal controls,and the sFas lev

6、els in severe AA were much lower than those in chronic AA (P<0.05). The percentage of CD34+Fas+ cells was negatively correlated with sFas level. ConclusionFas/FasL system aberration is involved in the pathogenesis of AA. 【Key words】Anemia, aplastic；Antigens, CD95；LigandFas(CD95)是人體多種細(xì)胞表面的一種型膜蛋白，屬

7、于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，F(xiàn)as的可溶性形式(sFas）由蛋白水解酶水解膜結(jié)合Fas或由Fas變異體mRNA翻譯而成。Fas配體(FasL)是細(xì)胞表面的一種型膜蛋白，屬于TNF家族，主要表達(dá)于激活的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞。由金屬蛋白酶類裂解膜結(jié)合FasL而形成一種可溶性形式，即sFasL1。細(xì)胞表面的Fas通過(guò)與FasL結(jié)合可導(dǎo)致敏感細(xì)胞的凋亡。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，再生障礙性貧血（再障）患者CD34+細(xì)胞Fas抗原表達(dá)增高2，干擾素（IFN-）和腫瘤壞死因子（TNF-）都能誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞的凋亡3，提示再障的免疫發(fā)病機(jī)制與Fas/FasL系統(tǒng)有關(guān)4。我們測(cè)定了32例再障患者骨髓C

8、D34+細(xì)胞、CD34-細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMNCs） Fas抗原的表達(dá)及血漿sFas、sFasL水平，分析血漿sFasL水平與Fas表達(dá)的相關(guān)性，以探討Fas/FasL在再障發(fā)病中的作用和臨床意義。病例和方法1病例所有病例均來(lái)自山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診及血液科住院患者。32例再障患者均符合1987年第四屆全國(guó)再障會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)5，其中慢性再障（CAA）23例，重型再障（SAA）型7例，型2例；男15例，女17例；年齡971歲，中位年齡為33.5歲。病程為7天10余年。對(duì)照組骨髓標(biāo)本10份(例)，取自胸外科非血液系統(tǒng)疾病患者手術(shù)切除肋骨；對(duì)照組血液標(biāo)本24份，其中10份取自上述胸外

9、科手術(shù)患者，其余14份取自健康獻(xiàn)血員。2標(biāo)本處理肝素抗凝新鮮骨髓及血液標(biāo)本用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，供流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。另取2ml抗凝血，分離血漿，于80保存，待測(cè)。3檢測(cè)方法sFas、sFasL試劑盒購(gòu)自深圳晶美公司，按說(shuō)明書進(jìn)行操作。CD34、Fas的標(biāo)記均用直接免疫法，抗體為抗CD34-PE、抗Fas-FITC（PharMingen公司），流式細(xì)胞儀為FACS Vantage(BD公司)。4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)及相關(guān)分析。結(jié)果1再障患者組與對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)、PBMNCs Fas抗原的表達(dá)以CD34+Fa

10、s+細(xì)胞占CD34+細(xì)胞的百分率來(lái)對(duì)骨髓CD34+細(xì)胞Fas表達(dá)進(jìn)行分析。由表1可見(jiàn)，對(duì)照組CD34+Fas+細(xì)胞百分率為（21.66±5.45）%，SAA組CD34+Fas+細(xì)胞百分率為（39.50±5.99）%，CAA組患者CD34+Fas+細(xì)胞百分率為（30.52±10.66）%，SAA組與CAA組均明顯高于對(duì)照組，差異有顯著性（分別為P<0.01，P<0.05），SAA組與CAA組比較，SAA組CD34+Fas+細(xì)胞百分率高，差異有顯著性（P<0.05）。SAA組及CAA組患者骨髓CD34-細(xì)胞、PBMNCs Fas表達(dá)高于對(duì)照組，但差異

11、無(wú)顯著性（P>0.05）。組別例數(shù)BMMNCsPBMNCsCD34+Fas+CD34-Fas+Fas+對(duì)照組1021.66±5.4545.31±13.2943.99±11.38SAA組939.50±5.9951.43±13.4551.27±13.56CAA組2330.52±10.6650.22±15.9250.99±16.47      注：SAA組，CAA組與對(duì)照組相比，P<0.01，P<0.05；SAA組與CAA組相比，P<0.05 2再

12、障患者骨髓CD34+細(xì)胞Fas表達(dá)與病程的關(guān)系動(dòng)態(tài)觀察再障患者骨髓CD34細(xì)胞Fas表達(dá)，可見(jiàn)CD34+Fas+細(xì)胞百分率與病程呈負(fù)相關(guān)，SAA組r=0.626，P<0.01；CAA組r=0.883，P<0.01。發(fā)病早期，特別是前2個(gè)月，CD34+Fas+細(xì)胞百分率明顯高于中、后期(1)。     1再障患者骨髓CD34Fas細(xì)胞百分率與病程的關(guān)系3再障患者血漿sFas、sFasL的水平由表2可見(jiàn)，SAA及CAA組患者血漿sFas水平比對(duì)照組低，SAA組降低尤為明顯，差異有顯著性（P<0.01），SAA組sFas低于CAA組，差異有顯

13、著性（P<0.05）。SAA及CAA組患者血漿sFasL水平與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性（P>0.05）。組別例數(shù)sFassFasL對(duì)照組245.17±1.050.20±0.07SAA組92.59±0.770.25±0.10CAA組233.85±1.290.21±0.10     注：SAA組，CAA組與對(duì)照組相比，P<0.01，P<0.05；SAA組與CAA組相比，P<0.054再障患者細(xì)胞膜表面Fas抗原的表達(dá)與血漿sFas水平的相關(guān)性血漿sFas與CD34+Fa

14、s+細(xì)胞百分率呈負(fù)相關(guān)，SAA組r=0.925，P<0.01；CAA組r=0.732，P<0.05。討 論Fas是TNF受體家族的一個(gè)受體，為相對(duì)分子質(zhì)量45×103的膜蛋白，廣泛表達(dá)于人體多種細(xì)胞。抗Fas抗體、細(xì)胞膜表面FasL或血漿sFasL均可結(jié)合細(xì)胞表面Fas，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡6。Fas/FasL系統(tǒng)是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的一條重要的途徑。由蛋白水解酶裂解膜結(jié)合Fas或Fas變異體mRNA翻譯而成的Fas不含跨膜區(qū)，以可溶性形式存在于血液中，即sFas。sFas通過(guò)和細(xì)胞Fas分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FasL而阻斷Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡7。FasL是一種相對(duì)分子質(zhì)量為40×10

15、3的膜蛋白，表達(dá)于激活的T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、眼基質(zhì)細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞等。金屬蛋白酶裂解膜結(jié)合FasL形成相對(duì)分子質(zhì)量為26×103的糖蛋白，即sFasL。sFasL可與Fas結(jié)合，向攜帶Fas的細(xì)胞傳遞凋亡信號(hào)，因而，細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞可通過(guò)直接接觸或分泌sFasL而殺傷靶細(xì)胞。Maciejewski等2發(fā)現(xiàn)再障患者骨髓CD34+細(xì)胞Fas抗原表達(dá)增多，再障患者IFN-的表達(dá)明顯增高8，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IFN-和TNF-可誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞Fas抗原的表達(dá)3，再障患者骨髓活檢發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞凋亡增多9,10，提示再障的免疫發(fā)病機(jī)制與Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的凋亡有關(guān)。我們的研究不但證實(shí)了再障患者

16、骨髓CD34+細(xì)胞Fas表達(dá)增高，而且發(fā)現(xiàn)血漿sFas水平明顯降低，提示再障發(fā)病過(guò)程中不但存在凋亡因素的增多，而且存在抗凋亡因素的減少。這可能是再障患者骨髓造血干/祖細(xì)胞凋亡過(guò)多的重要原因之一。再障患者骨髓CD34+細(xì)胞Fas表達(dá)增高，而CD34-細(xì)胞Fas表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，提示再障患者骨髓中異常的造血干/祖細(xì)胞往往于早期在免疫應(yīng)答過(guò)程中被清除，能夠釋放到外周血中的白細(xì)胞多由正常的造血干/祖細(xì)胞分化而來(lái)。CAA和SAA患者骨髓CD34+Fas+細(xì)胞百分率、血漿sFas水平有明顯差異，提示二者在發(fā)病機(jī)制方面可能存在差異。sFas明顯減少可能由于蛋白水解酶活性降低，減少了對(duì)膜結(jié)合Fas的裂解

17、，或者與FasL+細(xì)胞、sFasL結(jié)合而消耗，尚需要進(jìn)一步探討。細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞與再障的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但我們的研究結(jié)果表明再障患者血漿sFasL并不增高，可能是由于分泌于血液的sFasL比膜結(jié)合FasL有更多的機(jī)會(huì)與Fas+細(xì)胞結(jié)合而傳遞凋亡信號(hào)，或者與sFas結(jié)合而被清除，但這都需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。無(wú)論是SAA患者，還是CAA患者，骨髓CD34+細(xì)胞Fas表達(dá)均與病程有關(guān)。發(fā)病初期，特別是前2個(gè)月，CD34+Fas+細(xì)胞百分率明顯增高，SAA組9例患者中有5例病程不超過(guò)2個(gè)月。CAA患者中病程短的，其CD34+Fas+細(xì)胞百分率與SAA組患者接近。由此認(rèn)為，SAA組比CAA組骨髓C

18、D34+Fas+細(xì)胞百分率高，原因之一是SAA組比CAA組患者病程短。設(shè)想在Fas與sFas，F(xiàn)asL與sFasL間存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)病初期Fas表達(dá)異常增高，然后通過(guò)反饋調(diào)節(jié)達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡。再障造血干細(xì)胞不僅數(shù)量減少，而且存在質(zhì)的異常11,12，可能對(duì)Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)敏感性增高，F(xiàn)as表達(dá)稍高于正常即可能損傷造血功能?；诖?，在發(fā)病初期對(duì)造血干細(xì)胞Fas表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，可保存造血干細(xì)胞的數(shù)量，阻止病情的進(jìn)一步發(fā)展。所有再障患者的各階段的造血細(xì)胞，從干細(xì)胞到血循環(huán)中的細(xì)胞成分都嚴(yán)重降低。大多數(shù)再障似乎是由免疫系統(tǒng)細(xì)胞及可溶性產(chǎn)物介導(dǎo)而引起造血細(xì)胞的破壞，至少有某些是通過(guò)Fas/FasL系

19、統(tǒng)和細(xì)胞凋亡途徑。在Fas/FasL系統(tǒng)調(diào)控方面，Shi等發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢霉素A可以阻斷細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加所引起的信號(hào)傳遞，環(huán)孢霉素A等免疫抑制劑治療對(duì)多數(shù)再障有效。對(duì)Fas/FasL系統(tǒng)進(jìn)行深入的研究有助于探討再障的發(fā)病機(jī)制，為再障的治療提供指導(dǎo)。 作者單位：任翠愛(ài)（250012濟(jì)南，山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院）張茂宏（250012濟(jì)南，山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院）徐從高（250012濟(jì)南，山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院）張銻（250012濟(jì)南，山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院）參 考 文 獻(xiàn)1，Tanaka M, Suda T, Haze K, et al. Fas ligand in human serum. Na

20、t Med, 1996, 2:317.2，Maciejewski JP, Selleri C, Sato T, et al. Increased expression of Fas antigen on bone marrow CD34+ cells of patients with aplastic anemia. Br J Haematol, 1995, 91：245-252.3，Maciejewski JP, Selleri C, Anderson S,et al . Fas antigen expression on CD34+ human marrow cells is induce

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