PCR-RNA轉(zhuǎn)錄本分子雜交用于急性淋巴細(xì)胞白血病微小殘留病的檢測

1、    PCR-RNA轉(zhuǎn)錄本分子雜交用于急性淋巴細(xì)胞 白血病微小殘留病的檢測        【摘要】目的為了快速、敏感地檢測急性淋巴細(xì)胞白血病(急淋)微小殘留病。 方法以T細(xì)胞受體鏈基因重排為標(biāo)志基因，將確診時標(biāo)本擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成放射標(biāo)記的RNA探針，而不同病期標(biāo)本的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成待測RNA，待測RNA與探針雜交后經(jīng)RNase A消化，之后再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影。 結(jié)果急淋細(xì)胞系DNA對數(shù)稀釋試驗表明本方法的敏感度在10-5水平。1例急淋完全緩

2、解期微小殘留病也被成功地檢測出來。而當(dāng)探針和待測RNA并非來自同一個體時，交叉雜交的結(jié)果為陰性。 結(jié)論為臨床檢測急淋微小殘留病提供了一種有效手段?！娟P(guān)鍵詞】聚合酶鏈反應(yīng)T細(xì)胞受體鏈基因重排微小殘留病急性淋巴細(xì)胞白血病DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA USING PCR-MOLECULE HYBRIDIZATION OF RNA TRANSCRIPTSLiang Xinquan*【Abstract】ObjectiveTo detect acute lymphoblastic leukemia

3、's (ALL's)minimal residual disease(MRD) rapidly and effectively.MethodsIn this assay, the gamma T-cell receptor gene rearrangements serve as marker genes. The gene rearrangements are amplified from the diagnostic specimens using a consensus V segment primer and a consensus J segment primer t

4、o which the promoter T7 RNA polymerase has been appended. The PCR product from this amplification is transcribed into a radiolabeled RNA probe. The opposite DNA strand is transcribed into test RNA from the PCR product of different staged specimens. The test RNA is hybridized with the probe, and late

5、r the digestion with RNase A, Polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography are in progress.ResultsAccording to the mechanism, the perfectly matched RNA duplex can prevent the digestion of RNase A, and the presence of the leukemia cells in the test specimen can be determined. Logarithmical

6、dilution experiments with DNA of a cell line from ALL have shown that this assay's sensitivity is at the 10-5 level. Minimal residual disease was successfully detected in a case of ALL during its complete remission stage. But if the probe and test RNA are not from the same individual, the result

7、s of this kind of cross hybridization are negative.ConclusionThe above results suggest that this assay can become an effective measure in the detection of ALL-MRD clinically.【Key words】Polymerase chain reactionGamma T-cell receptor gene rearrangementMinimal residual diseaseAcute lymphoblastic leukem

8、ia目前，在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)微小殘留病(MRD)的檢測中，常以免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因的克隆性重排作為標(biāo)志基因，我們選用T細(xì)胞受體鏈基因重排(TCR)作標(biāo)志基因，采用PCR-RNA轉(zhuǎn)錄本分子雜交法檢測ALL-MRD，現(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1細(xì)胞系和患者標(biāo)本SUP-B7細(xì)胞系細(xì)胞，來自1例CALL患者的白血病細(xì)胞，含有TCR基因重排1。例1為6歲女性ALL患兒，F(xiàn)AB分型為L1，免疫分型為非T-型，其DNA標(biāo)本分別取自患者確診時和完全緩解期(CR)骨髓。1.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)體系50l，模板DNA(苯酚抽提)0.51.0g，每種引物25pmol，引物序列為：(1)擴(kuò)

9、增探針標(biāo)本引物：P1為5GCTAATAC-GACTCACTATGGGAGAGACAACAAGTGTTGT-TCCAC；P2為5CGGCTACATCCACTGGTACCT。(2)擴(kuò)增待測標(biāo)本引物：T1為5GCTAATACGACTC-ACTATGGGAGACGGCTACATCCACTGGTACCT；T2為5GTTCCACTGCCAAAGAGTTTCTT。Taq DNA聚合酶2U，4×dNTP終濃度各100mol/L。每輪擴(kuò)增為94 60秒(第1輪240秒)，60 120秒，7090秒(最后1輪360秒)，共30輪。每份PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳時可見一預(yù)知大小的單一條帶為陽性結(jié)果。1.3

10、體外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄體系50l，PCR產(chǎn)物6l作模板，T7 RNA聚合酶50U，各自終濃度為4mmol/L的4種單核苷酸，轉(zhuǎn)錄放射標(biāo)記的探針時用74mBq/ml(2mCi/ml)-32P-UTP代替普通的UTP，RNasin 10U。上述混合液在37水浴中孵育15分鐘，再經(jīng)RNase-free DNase I 1U(Life Technologies公司)消化以去除模板DNA。上述轉(zhuǎn)錄本經(jīng)苯酚抽提、無水乙醇沉淀后重溶于80l雜交緩沖液中。1.4RNA轉(zhuǎn)錄本分子雜交及RNase A消化探針RNA與相應(yīng)的待測RNA以19的比例在總體積40l的雜交緩沖液中雜交。雜交混合物經(jīng)9510分鐘后轉(zhuǎn)入64水浴中孵育過

11、夜。次日加入40gml RNase A300l，4250水浴中消化30分鐘；隨后加入10% SDS 20l以終止消化。1.5放射自顯影雜交產(chǎn)物經(jīng)含7.6molL尿素的6%聚丙烯酰胺凝膠(PAG)電泳。電泳后的PAG經(jīng)冰乙酸固定后置X光膠片在-20曝光過夜。2結(jié)果2.1實驗原理如1所示，我們所用2對引物P1P2和T1T2分別互補于TCR重排基因內(nèi)相差13個堿基的保守序列2，其PCR產(chǎn)物分別被轉(zhuǎn)錄成放射標(biāo)記的RNA探針和未標(biāo)記的RNA待測分子。在兩對引物中，P1和T1分別在5端帶有T7 RNA聚合酶啟動子3，目的是使兩份PCR產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄時分別以互補的兩條DNA單鏈為模板，其結(jié)果是轉(zhuǎn)錄成互補的兩個R

12、NA轉(zhuǎn)錄本。如引物P1P2和T1T2擴(kuò)增的是SUP-B7細(xì)胞系TCR重排基因，則其PCR產(chǎn)物的分子量分別是281bp和268bp，其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本分別為263bp和250bp。如果待測標(biāo)本中存在來自探針標(biāo)本的特異性重排基因，那么探針和待測RNA雜交后形成的精確配對的RNA雙鏈能抵抗RNase A的消化，電泳后未被消化的探針分子量為244bp(探針5突出的19bp單鏈被消化了)；如果待測標(biāo)本中不含探針標(biāo)本中的特異性重排基因，則雜交后的RNA雙鏈因存在不完全配對而被RNase A消化斷裂，電泳后則只能看到分子量更小的探針片段。2.2敏感度與特異性 1實驗原理示意Fig 1The assay'

13、s schematic representation純細(xì)胞系DNA制備探針用正常人DNA按對數(shù)級別稀釋SUP-B7細(xì)胞系DNA。取不稀釋的SUP-B7DNA制備成探針；以不稀釋及各種稀釋濃度的SUP-B7 DNA制備成待測RNA，雜交后的結(jié)果如2。未雜交且未經(jīng)RNase A消化的探針為一預(yù)知分子量為263bp的條帶4(第9道)；當(dāng)雜交混合液中不加待測RNA時，探針被完全消化了(第8道)；而當(dāng)探針與未稀釋DNA制備的待測RNA雜交時，則可見到不被消化的探針(分子量244bp，第1道)，隨后的第27道表明，這條帶的強(qiáng)度隨著待測標(biāo)本按對數(shù)級別2SUP-B7細(xì)胞系對數(shù)稀釋敏感度試驗Marker系pBR

14、322Hae PAG電泳后銀染色結(jié)果3不純細(xì)胞系探針敏感度試驗(第14道)；病例1 MRD檢測(第57道)；交叉雜交結(jié)果(第811道)Fig 2Logarithmical dilution sensitivity test of SUP-B7, a cell line. Marker is the pBR 322/Hae , PAG electrophoresis, silver nitrate dyeing;Fig 3Sensitivity test of the impure cell line's probe (lane 1 to 4); Detection of case 1

15、MRD (lane 5 to 7); Result of the cross hybridization (lane 8 to 11)逐漸被稀釋而降低，至10-6-2濃度的SUP-B7 DNA制備成RNA探針，分別與10-2、10-3、10-4濃度水平的待測RNA雜交，結(jié)果3個雜交產(chǎn)物均可檢測到不被消化的探針(依次見3中的13道)。第4道為未雜交亦未經(jīng)RNase A消化的10-27探針與例1確診標(biāo)本制備的待測RNA雜交，上述結(jié)果均未見到不被消化的探針(見3第811道)。2.3臨床病例MRD的檢測將例1確診時標(biāo)本制備成探針，分別與其確診標(biāo)本和CR期標(biāo)本制備的待測RNA雜交，結(jié)果均可見不被消化的探

16、針，前者的強(qiáng)度比后者稍強(qiáng)(見3第5、6道，第7道為未雜交亦未經(jīng)RNase消化的探針，中顯示其分子量分別與SUP-B7相當(dāng))。3討論文獻(xiàn)報道，幾乎所有的T系A(chǔ)LL和40%70%的B系A(chǔ)LL均有克隆性的TCR基因重排，這說明以其作為標(biāo)志基因涵蓋面較大。我們對SUP-B7細(xì)胞系DNA的對數(shù)稀釋試驗表明本方法的敏感度在10-5水平，而Southern雜交的敏感度是無法與其相比的，而且即使用10-2濃度DNA制備的探針仍可檢測10-4水平的待測RNA，說明臨床即使使用不純的腫瘤細(xì)胞標(biāo)本制備探針，其敏感度亦不存在大的影響。存在于ALL患者的克隆性Ig或TCR重排基因，其結(jié)合區(qū)在重排時由于隨意插入和丟失的單

17、核苷酸及其數(shù)目不同而使每一病例具有個例特異性。為了保證檢測ALL-MRD方法的特異性，可靠的方法是利用重排基因結(jié)合區(qū)序列的這一特性，(1)對確診標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；(3)根據(jù)測序結(jié)果合成一條與結(jié)合區(qū)序列互補的寡核苷酸引物或探針；(4)對待測標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增或分子雜交57。這些措施確實較好地保證了方法的特異性，但問題是對每一病例進(jìn)行測序和寡核苷酸合成既費時費力又相當(dāng)昂貴。因此有人對確診標(biāo)本的IgH CDR 基因的PCR產(chǎn)物分離出單鏈后標(biāo)記成探針，與不同病期的PCR產(chǎn)物雜交，雜交產(chǎn)物再經(jīng)S1核酸酶消化而獲得最后結(jié)果8，這在方法上就大大簡化了。我們這里通過兩對引物上T7啟

18、動子的作用，使探針與待測RNA互為互補，根據(jù)精確配對的RNA雙鏈能抵抗RNase A消化的原理，可以通過雜交后的消化結(jié)果確定待測標(biāo)本中特異性重排基因的存在與否。這樣，在保證了特異性的基礎(chǔ)上使本方法更為簡便，更利于臨床應(yīng)用。病例與正常人及細(xì)胞系之間的交叉雜交結(jié)果陰性及臨床CR期標(biāo)本MRD的成功檢測正好證明了這一點。志謝美國Emory大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科血液病所周木想教授提供SUP-B7細(xì)胞系DNA參考文獻(xiàn)1Smith SD, Shatsky M, Cohen PS, et al. Monoclonal antibody and enzymatic profiles of human malignant

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