LMP1與綠色熒光蛋白融合基因慢病毒的制備(一)

1、LMP1與綠色熒光蛋白融合基因慢病毒的制備(一)    作者：李先茂，趙彤,朱梅剛,張三泉，張進華【關鍵詞】 聚合酶鏈反應Production of lentivirus of LMP1 and GFP recombinant gene【Abstract】 AIM: To produce lentivirus of latentmembrane protein 1 (LMP1) and green fluorescent protein (GFP) recombinant gene. METHODS: The fragment including all

2、 the exons of LMP1 was amplified by RTPCR and was recombined to the downstream of CMV promoter in the lentivirus vector FUGW. The three plasmids expressing lentivirus packaging plasmid pCMV.8.9, envelope plasmid VSVG and target plasmid FUGWLMP1 were packaged into virus packaging cell line 293FT usin

3、g lipofectamine method. The virusproducing cell supernatant was harvested and concentrated. RESULTS: It was proved that the sequence of the RTPCR product was totally consistent with the data of GenBank by DNA sequencing analysis. The LMP1 cDNA fragment was cloned in the vector FUGW in the right dire

4、ction and the open reading fragment of LMP1 was maintained. The three plasmids were effectively transferred into 293FT. Much green fluorescence was observed by fluorescence microscopy. CONCLUSION: The lentivirus of LMP1 and GFP recombinant gene are successfully produced.【Keywords】 latent membrane pr

5、otein 1; polymerase chain reaction; lentivirus【摘要】 目的: 制備EB病毒LMP1與綠色熒光蛋白（GFP）融合基因慢病毒. 方法: 采用RT PCR方法獲得LMP1全外顯子片段,使之克隆到帶綠色熒光蛋白慢病毒表達載體質(zhì)粒FUGW中. 經(jīng)限制性酶切、PCR擴增和測序鑒定重組載體. 在脂質(zhì)體介導下將慢病毒包裝系統(tǒng)的包裝結(jié)構(gòu)基因pCMV.8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGWLMP1導入病毒包裝細胞293FT， 熒光顯微鏡檢測基因的表達，包裝成病毒后，收集病毒上清，濃縮，PCR鑒定. 結(jié)果： 限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序分析證實RTPCR獲得的LM

6、P1 cDNA片段與GenBank中的數(shù)據(jù)完全吻合; LMP1準確克隆入FUGW的多克隆位點. 慢病毒的3種質(zhì)?？筛咝мD(zhuǎn)染入293FT細胞，熒光顯微鏡下觀察可見大量的綠色熒光. 綠色熒光位于細胞的胞膜及胞質(zhì). 結(jié)論: 成功制備了LMP1與GFP融合基因慢病毒，為研究EBV瘤基因LMP1在多種疾病中的作用機制提供適合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的載體.【關鍵詞】 潛伏膜蛋白1;聚合酶鏈反應;慢病毒0引言EB病毒(EpsteinBarr virus,EBV)與淋巴瘤、鼻咽癌、傳染性單核細胞增多癥等多種疾病密切相關. 該EB病毒可編碼至少60種產(chǎn)物,其中潛伏膜蛋白1 (latentmembrane protein

7、 1, LMP1)具有廣泛的細胞生物學功能1，在淋巴細胞體外轉(zhuǎn)化和永生化的過程中起重要作用; 經(jīng)LMP1轉(zhuǎn)化了的B淋巴細胞不僅在形態(tài)上發(fā)生了改變,而且具有使裸鼠致瘤的能力2,3. 如何將基因高效轉(zhuǎn)染及長期穩(wěn)定表達成為人們研究的熱點. 近期研究者把目光投向了以型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1, HIV1)為代表的慢病毒不僅具有可感染非分裂期的細胞、目的基因整合至靶細胞基因組長期表達、免疫反應小等優(yōu)點4，而且對重組包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒及重組目的基因穿梭質(zhì)粒進行了改造后，極大降低了其自我復制能力,使安全性大大提高，有望成為理想的基因載體5. 我們

8、采用RTPCR方法獲得LMP1全外顯子片段,并將其克隆入慢病毒表達載體并進行了序列測定,利用包裝細胞293FT制備了慢病毒，旨在制備LMP1與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合基因慢病毒，為研究EBV瘤基因LMP1在多種疾病中的作用機制提供適合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的載體.1材料和方法11材料質(zhì)粒pCMV.8.9, FUGW及VSVG由美國Carlos Lois博士惠贈，pCMV.8.9為包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒，主要起病毒包裝功能，表達酶蛋白形成病毒衣殼結(jié)構(gòu)； VSVG為包膜質(zhì)粒;大腸桿菌JM109(本室凍存菌種); EBV感染絨猴淋巴細胞株95.8(本室凍存細胞株)

9、一步法RTPCR試劑盒,購自Gibco公司;限制性內(nèi)切酶BamH和Taq酶、T4 DNA連接酶、RNase, 瓊脂(B.M.,寶靈曼);低熔點瓊脂糖(FMC);dNTP, PCR marker, 普通瓊脂糖、10 g/L EB(華美生物公司);胰蛋白胨和酵母提取物(Oxiod); Tris堿();其他試劑(均為國產(chǎn)分析純).12方法121引物設計根據(jù)EBV基因組(95.8來源)序列,設計合成了兩條引物, 上游和下游引物分別對應于EBV基因組的169 474169 456 bp與168 163168 181 bp處,并且引入了限制性內(nèi)切酶BamH的識別位點(上海生工生物工程公司合成).122RT

10、PCR法擴增LMP1 cDNA以下所用的常規(guī)方法參照文獻6. 總RNA抽提用TRIzol試劑抽提95.8細胞的總RNA,DNAse處理去除DNA污染. 瓊脂糖凝膠電泳觀察有無降解,測定其在260與280下的吸光度,計算吸光度比值和總RNA的含量. 逆轉(zhuǎn)錄反應：使用SUPERCRIPTTM ONE STEP RTPCR system進行逆轉(zhuǎn)錄PCR. 反應體系為: 2 L(約為2 g)總RNA模板,2×反應液25 ,下游引物(10 mol/L) 1 L, 2.5 mmol/L MgCl2溶液0.6 L,酶混合物1 L,最后用滅菌DEPC水補足至49 L,50下,保溫60 min. 加上

11、游引物(10 mol/) 1 L,在PCR熱循環(huán)儀上進行以下反應: 94, 2 min; 94, 40 s56, 1 min72, 1 min 30 s,共35個循環(huán); 72延伸8 min. 取5 L反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析.123FUGWLMP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因與FUGW質(zhì)粒的酶切及純化常規(guī)方法制備并純化質(zhì)粒. 目的基因和FUGW經(jīng)BamH單酶切后,用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的純化片段. FUGW質(zhì)粒純化片段去磷酸化處理. 目的基因與FUGW的連接反應FUGW酶切純化質(zhì)粒1 L(約0.1 g), LMP1 cDNA酶切純化產(chǎn)物5 L(約0.4 g),4連接酶1 L (1 )

12、, 10×反應緩沖液1 L,用水補足至10 L, 16連接20 h. 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5. 將10 L連接產(chǎn)物加入100 L感受態(tài)菌中,冰浴30 min,42熱休克90 s,立即靜置冰浴2 min,加入800 L LB培養(yǎng)基, 37 100 r/min振搖45 min. 用無菌擴散棒將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于含有100 mg/氨芐的LB選擇平板上倒置培養(yǎng)過夜.124LMP1基因表達載體的限制性酶切鑒定及序列測定篩選數(shù)個陽性菌落,微量快速法提取質(zhì)粒DNA,進行限制性酶切和PCR擴增. 委托上海博亞公司對重組載體進行序列測定,取與GenBank所公布的相應序列

13、正向相符的質(zhì)粒.125慢病毒的包裝、濃縮及鑒定按照操作說明，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM進行目的基因的轉(zhuǎn)染. 在脂質(zhì)體的介導下將上述質(zhì)粒分兩組（實驗組、對照組）混合轉(zhuǎn)染入293FT細胞，質(zhì)粒為3種質(zhì)粒混合，即包膜質(zhì)粒（VSVG）、包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒（8.9）、目的基因重組質(zhì)粒（FUGWLMP1為實驗組，F(xiàn)UGW為對照組），3種粒濃度混合比例（g/L）為543. 2448 h后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)大量熒光后收集病毒上清，收集的病毒上清濃縮后分裝備用或立即使用. 重組慢病毒活性測定: 將濃縮后的病毒貯存液作不同比例稀釋，熒光分光光度計檢測上清中病毒. 另外取500 L加至293FT細胞培

14、養(yǎng)瓶中，加入polybrene（聚凝安）終濃度為8 mg/L于37吸附30 min，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1824 h，于熒光顯微鏡下觀察.2結(jié)果總RNA抽提用TRIzol試劑抽提的B95.8細胞總RNA的質(zhì)量良好. A260 nm/A280 nm=1.8. LMP1 cDNA的RTPCR所設計引物位于LMP1全外顯子的上下游,包含起始密碼子,不包含終止密碼子，擴增片段大小為1.1 kb. RTPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳見一清晰的特異性擴增條帶,其大小與理論預期值相符. 基因慢病毒表達載體構(gòu)建和鑒定：構(gòu)建的基因表達載體經(jīng)BamH單酶切,獲得與目的基因一致的清晰條帶,而空載質(zhì)粒上只有9956 bp

15、的單一片段（Fig 1）. 測序：DNA測序的結(jié)果表明，我們所獲得的LMP1 cDNA與GenBank所公布的相應序列正向相符，無堿基缺失及錯誤. 慢病毒包裝結(jié)果： 用質(zhì)脂體將已構(gòu)建的慢病毒載體系統(tǒng)中3種質(zhì)粒成分轉(zhuǎn)移至包裝細胞293FT中,熒光顯微鏡下見大量綠色熒光,證實已有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293FT細胞，綠色熒光位于細胞的胞膜及胞質(zhì)（Fig 2,3）這與LMP1的表達位置一致. 熒光分光光度計檢測病毒上清 ,設激發(fā)波長為470 nm,測到510 nm處激發(fā)出熒光; 取病毒上清感染293FT，熒光顯微鏡下觀察細胞膜上及胞質(zhì)中有綠色熒光分布，說明制備的慢病毒有活性.3討論我們選用復制HIV1作為載

16、體，制備了EB病毒LMP1與熒光蛋白融合基因慢病毒. 復制缺陷型HIV1載體由目的基因載體成分、包裝結(jié)構(gòu)成分和包膜結(jié)構(gòu)成分三部分組成. 目的基因載體成分是將HIV 3端LTR中的U3部分切短，使之喪失啟動病毒復制功能，同時插入CMV啟動子的調(diào)控，即成為復制缺陷型病毒載體. 包裝結(jié)構(gòu)成分由HIV1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，但能夠提供產(chǎn)生病毒顆粒所必須的蛋白，如gag和pol蛋白，極大降低了其自我復制能力,使安全性大大提高. 為了便于觀察研究,本研究中采用新型報告基因綠色熒光蛋白(GFP)基因,將其與LMP1基因共同構(gòu)建至載體上.GFP作為報告基因的特點和優(yōu)勢在于:

17、GFP在470 nm波長處可吸收激發(fā)光,在510 nm發(fā)射綠色熒光, 只要有足夠的表達,在紫外光照射下,無需引入別的物質(zhì),在活體內(nèi)通過顯微鏡就能清晰地觀察到. 而其他一些報告基因如氯霉素、乙酰轉(zhuǎn)移酶7、半乳糖苷酶、熒光素酶等都需要用底物、輔助因子等參與才能檢測其活性. 因此, GFP作為報告基因具有觀察簡單方便和直觀的優(yōu)點8. 本研究在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,通過熒光顯微鏡觀察到細胞膜上及胞質(zhì)中有大量綠色熒光,說明已有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293FT細胞;進一步收集病毒上清,初步證實了慢病毒包裝成功,存在于病毒上清中，為研究EBV瘤基因LMP1在多種疾病中的作用機制提供適合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的載體.【參考文獻】1 P

18、anagopoulos D, Victoratos P, Alexiou M, et al. Comparative analysis of signal transduction by CD40 and the EpsteinBarr virus oncoprotein LMP1 in vivoJ. J Virol, 2004;78(23):13253-13261.2 Li W, Wu BA, Zeng YM, et al. EpsteinBarr virus in hepatocellular carcinogenesisJ. World J Gastroenterol, 2004;10(23):3409-3413.3 Cherney BW, Sgadari C, Kanegane C, et al. Expres