p38絲裂原活化蛋白激酶在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后的磷酸化及其意義(一)

1、p38絲裂原活化蛋白激酶在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后的磷酸化及其意義(一)    【摘要】 目的： 觀探討大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化及其意義. 方法： 采用升高眼內壓的方法，制作實驗性視網(wǎng)膜缺血再灌注大鼠模型. 將30只Wistar大鼠隨機分為正常組（n=6）和缺血再灌注組（n=24），其中缺血再灌注組又分為再灌注后2，12，24，72 h等4個時間段（每時間段6只）. 應用Western Blot法檢測視網(wǎng)膜組織中p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK （pp38 MAPK）蛋白的表達變化. 結果：

2、 p38 MAPK在缺血再灌注組各時間點的視網(wǎng)膜組織內的表達保持相對恒定，與正常對照組相比無統(tǒng)計學上的變化（P>0.05）. pp38 MAPK的表達水平在缺血再灌注組12 h時即有明顯升高，24 h時達到高峰，72 h時仍維持較高的表達水平，與正常對照組相比有統(tǒng)計學著差異（P0.01）. 結論： p38 MAPK信號通路的激活可能與缺血再灌注所造成的視網(wǎng)膜損傷有密切關系. 【關鍵詞】 視網(wǎng)膜；再灌注損傷；p38絲裂原活化蛋白激酶類；印跡法，蛋白質；大鼠0引言視網(wǎng)膜缺血再灌注（retina ischemiareperfusion injury）損傷主要發(fā)生在視網(wǎng)膜動靜脈阻塞、未成熟的視網(wǎng)

3、膜病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜血管阻塞所致的缺血性疾病中，它們均可造成不同程度的視網(wǎng)膜缺血. 在缺血再通后，視網(wǎng)膜反而受到更為嚴重的損傷，造成視功能下降1- 2. 因此，加強對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷機制的研究是非常重要的. 目前視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的機制尚未完全闡明，本實驗通過建立大鼠的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，觀察絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）家族成員之一的p38 MAPK蛋白在缺血再灌視網(wǎng)膜中的表達以及其磷酸化的時相變化，探索p38 MAPK在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的可能作用，為臨床治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷類疾病提供理論

4、依據(jù).1材料和方法1.1材料成年健康Wistar大鼠30只，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供. 雌雄不拘，體質量270300 g，室溫環(huán)境飼養(yǎng). 小鼠抗p38 MAPK及小鼠抗磷酸化p38 MAPK (pp38 MAPK)單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；山羊抗actin多克隆抗體購自美國Chemicon公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗小鼠或山羊二抗購自Chemicon公司；ECL化學發(fā)光試劑盒、PVDF膜購及Hyperfilm膠片自美國Amersham公司；蛋白質提取及濃度測定試劑盒購于美國BioRad公司.1.2方法1.2.1視網(wǎng)膜缺血再灌注模型的建立動物隨機分成兩組：正常對照

5、組（6只）和缺血再灌注組（24只）. 缺血再灌注組又分為再灌注后2, 12, 24, 72 h等4個時間段（每時間段6只大鼠）. 以前房灌注升高眼壓的方法制備大鼠視網(wǎng)膜缺血. 再灌注損傷模型，具體方法為： 大鼠以水合氯醛麻醉(400 mg/kg)，將生理鹽水瓶連接輸液器，升高輸液瓶至于大鼠眼垂直距離為150 cm左右處，灌注壓力達到110 mm Hg (14.63 kPa). 將連接輸液器的7號頭皮針自大鼠顳側角膜緣穿刺入前房，手術顯微鏡直視下可見灌注壓平衡后，視網(wǎng)膜蒼白水腫，表明視網(wǎng)膜中央動脈供血已被完全阻斷. 60 min后降低液瓶高度至27 cm以下(20 mm Hg)，此時可見視網(wǎng)膜變

6、紅，表明視網(wǎng)膜血管重新開放，已形成再灌注. 此時拔出前房灌注針頭，再灌注計時開始.1.2.2視網(wǎng)膜內p38MAPK和pp38MAPKA的檢測 視網(wǎng)膜組織蛋白質的提?。赫φ战M動物及再灌注后第2, 12, 24, 72 h的動物以水合氯醛麻醉，快速取雙側眼球，分離出視網(wǎng)膜，液氮中速凍. 加入裂解緩沖液（0.15 mol/L NaCl, 0.05 mol/L Tris, 0.1 mg/L SDS，0.1 mg/L苯甲磺酰氟，1 g/L抑蛋白酶肽，1 mg/L NP40）. 勻漿，冰上裂解30 min，4 12000 g離心20 min，吸上清，-70保存. 蛋白質SDSPAGE及電轉?。河玫鞍锥?/p>

7、量試劑盒測定蛋白質濃度，取20 g蛋白，進行125 g/L的聚丙烯酰胺凝膠電泳. 電泳結束后，用BioRad半干電轉移裝置將蛋白質轉印至PVDF膜，用含50 mg/L脫脂奶粉的PBST溶液（0.2 mmol/L PBS，0.02 g/L吐溫20）封閉，室溫2 h. Western Blot檢測：分別加入p38 MAPK（12000）， pp38 MAPK（12500）和actin（15000）抗體，室溫過夜. PBST洗膜，10 min×3次，再加入HRP結合的羊抗小鼠IgG（15000）或驢抗山羊IgG（15000），室溫孵育2 h. PBST洗膜后，加入ECL顯色劑，置暗室曝光.

8、 曝光后的膠片進行顯影、定影，用UVP凝膠成像系統(tǒng)對膠片上的條帶進行掃描分析.統(tǒng)計學處理：用Labworks軟件對各陽性條帶的密度進行測量，測得的p38 MAPK和pp38 MAPK陽性條帶的密度與相應的actin條帶密度的比值作為其蛋白的相對表達量，采用SPSS10.1分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析以及兩兩比較的Dunnettt檢驗.2結果Western blot顯示，在正常大鼠視網(wǎng)膜中檢測到了pp38 MAPK, p38MAPK和actin蛋白的表達，其中p38 MAPK和actin有較高的表達水平，而pp38 MAPK僅有微弱的表達（圖1）. 作為內參照的actin在正常海馬組織和缺血再

9、灌注后不同時間點的視網(wǎng)膜中的表達水平相當，表明在實驗中所加的蛋白量基本一致. p38 MAPK在缺血再灌注組各時間點的視網(wǎng)膜內的表達保持相對恒定，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）. pp38 MAPK的表達水平在再灌注后2 h時有輕度增加，但與正常對照組相比無顯著差異. 其表達水平在再灌注12 h時明顯升高，24 h時達到高峰，72 h時仍維持較高的表達水平，與正常對照組相比有統(tǒng)計學差異（P0.01），分別是其在正常組海馬組織中表達水平的3.9, 5.8和3.4倍（圖1, 2）.圖1正常對照組（C）和缺血再灌注后不同時間點大鼠視網(wǎng)膜內pp38 MAPK，p38 MAPK和

10、actin蛋白的表達（略）bP0.01 vs正常對照.圖2正常對照組和缺血再灌注后不同時間點大鼠視網(wǎng)膜內pp38 MAPK和p38 MAPK蛋白的相對表達水平（略）3討論視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科臨床很常見的病理生理過程. 由于供應視網(wǎng)膜血液的中央動脈為終末動脈，因此視網(wǎng)膜缺血及循環(huán)障礙，會導致視網(wǎng)膜嚴重損傷. 以往觀點認為，恢復血液再灌注是挽救視網(wǎng)膜缺血的重要途徑. 但近年的研究表明，視網(wǎng)膜在經(jīng)歷一定時間（60 90 min）的缺血后其功能并無變化，但是在再灌注后卻出現(xiàn)明顯的功能障礙，甚至出現(xiàn)不可逆的損傷，這就是視網(wǎng)膜的缺血再灌注損傷. 大量的研究表明，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)病機制較為復雜

11、，是多種因素綜合作用的結果，如氧自由基的損傷、微血管的損傷、白細胞的作用和鈣超載等，但是有關的分子機制尚不清楚3.MAPK在許多生長因子、細胞因子和受體激活早期信號轉導事件中起關鍵作用. 在受到刺激后，MAPK的蘇氨酸和酪氨酸殘基被磷酸化，激活它們內在的激酶活性，啟動一系列的細胞內信號通路. p38 MAPK是MAPK家族的主要成員之一，參與了神經(jīng)細胞的分化、存活等生理過程. 以往的研究還表明p38 MAPK與包括腦缺血、缺氧等多因素所導致的神經(jīng)細胞損傷有密切關系4，但是p38 MAPK的激活在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的作用目前還存在爭論. 本實驗中，我們觀察到缺血再灌注大鼠視網(wǎng)膜內p38 MA

12、PK的表達在各時間點沒有變化，但是pp38 MAPK的表達卻在再灌注后12 h明顯升高，24 h達到最高水平，72 h時仍然有很高的水平. 上述結果表明在缺血再灌注損傷后，視網(wǎng)膜組織內的p38 MAPK被激活，表現(xiàn)為磷酸化水平增高，提示p38 MAPK的活化在視網(wǎng)膜的缺血再灌注損傷中可能發(fā)揮著作用. 研究表明，視網(wǎng)膜在缺血再灌注損傷后，出現(xiàn)萎縮，視網(wǎng)膜細胞明顯減少. 視網(wǎng)膜細胞的減少主要是在內五層，這五層主要為神經(jīng)節(jié)細胞層和內核層，其中包含的主要細胞為神經(jīng)節(jié)細胞、雙極細胞、無長突細胞和水平細胞5. 既往研究報道，p38 MAPK主要表達于視網(wǎng)膜的無長突細胞和節(jié)細胞6. p38 MAPK的磷酸化

13、在上述兩種細胞的增殖和分化過程中具有重要作用. 那么，在視網(wǎng)膜缺血在灌注損傷后，p38 MAPK通路的激活發(fā)揮著何種作用，尚不清楚. 有研究提示，p38 MAPK抑制劑SB203580能夠有效抑制視神經(jīng)損傷所導致的視網(wǎng)膜節(jié)細胞的凋亡7. 還有研究表明，鈣通道阻滯劑尼莫地平對缺血再灌注損傷的視網(wǎng)膜具有保護作用，而且該保護作用可通過抑制p38 MAPK mRNA的表達來實現(xiàn)8.結合p38 MAPK主要表達的細胞類型，我們推測視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后p38 MAPK通路的激活可能與視網(wǎng)膜的無長突細胞和節(jié)細胞的損傷有密切的關系，進一步的研究正在進行中.【參考文獻】1 Osborne NN, Casson

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