兔缺血心肌中移植自體骨髓基質(zhì)干細胞的治療作用(1)

1、    兔缺血心肌中移植自體骨髓基質(zhì)干細胞的治療作用(1)    】 目的：驗證骨髓基質(zhì)干細胞（MSC）移植到缺血心肌中后是否在心肌的微環(huán)境中可以向心肌細胞分化，提高心功能. 方法：采用自體MSC體外培養(yǎng)擴增移植. 在通過結扎冠狀動脈造成急性心肌缺血后，被5溴2脫氧尿苷（BrdU）標記后的MSC移植到自體的缺血心肌中. 結果：移植4 wk后，MSC向肌細胞分化，表達出橫紋肌肌動蛋白（sarcomeric actin）和存在于閏盤中的connexin 43，移植后心肌表達VEGF增加(684±86) fg/

2、L vs (515±51） fg/L，P<0.05，缺血心肌局部血管密度增加(22.9±6.6)/HP vs (19.0±5.9)/HP，P<0.05，左室收縮功能明顯強于對照組LVSP: （15.08±0.84）kPa vs （13.26±0.68） kPa; LVEDP: （1.53±0.28）kPa vs（ 19.03±0.41） kPa; dp/dtmax: （ 615.77±48.69）kPa/s vs （ 435.75±58.25）kPa/s; -dp/dtmax: （-401.1

3、7±46.23） kPa/s vs （-338.25±50.72） kPa/s, P<0.05. 結論：MSC移植可治療心肌缺血，并且沒有免疫排斥反應.【關鍵詞】 骨髓基質(zhì)干細胞；缺血心??；移植0引言在離體實驗中發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細胞（marrow stromal cells，MSC）可以被5雜氮胞苷誘導為心肌細胞1. 由于自體MSC容易被獲取，而且具有較強的增殖能力，自體MSC應用于臨床可以不再需胚胎組織和應用免疫抑制劑，因此較其他來源的供體細胞更有優(yōu)勢. 為了同未來的臨床實踐相吻合，我們應用自體MSC移植入缺血心肌中，而沒有用被誘導后的MSC. 目的是著重探討移植后M

4、SC特異性蛋白的變化及其對與心功能的影響.1材料和方法1.1材料取健康雄性的新西蘭兔(2.53.5) kg（浙江大學醫(yī)學院動物實驗中心），經(jīng)耳緣iv戊巴比妥納（30 mg/kg）麻醉，用骨髓穿刺針無菌抽取骨髓，Percoll細胞分離液分離細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液用含200 mL/L胎牛血清的完全LDMEM（2 mmol/L L谷氨酰胺，1×104 U/L青霉素和25 g/L兩性霉素），37，50 mL/L CO2孵箱靜置培養(yǎng). 抽取的每個動物的骨髓基質(zhì)干細胞及每個動物均進行編號. 取傳第2代的MSC于移植前24 h用BrdU(5溴2脫氧尿苷, Sigma)標記骨髓基質(zhì)干細胞，10

5、 L BrdU貯液(BrdU, 50 mg; 二甲基亞砜0.8 mL; 三蒸水1.2 mL)加入5 mL完全培養(yǎng)液中. 移植前用PBS調(diào)整細胞密度為1×1011/L. 標記細胞的檢測（免疫組化）：先加2 mol/L鹽酸（室溫，50 min），正常山羊血清封閉10 min，不洗，甩掉，加含3 g/L Triton X100的140鼠抗Brdu mAb（抗體稀釋液稀釋），加入生物素標記的羊抗鼠抗體（室溫80 min），加入SABC復合物室溫50 min，DAB顯色，脫水、透明、封片.1.2方法30 g/L的戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經(jīng)耳緣iv麻醉. 心電圖導聯(lián)線與兔四肢相連接入八道生

6、理記錄儀之心電圖放大器（AC601G）記錄標準導聯(lián)心電圖. 在胸骨左緣胸肋關節(jié)處剪斷，肋骨開胸，剪開心包膜，用小拉鉤將心包膜固定于胸壁，充分暴露心臟. 用眼科小圓針在冠狀動脈左室支主干中上1/3處結扎，心電圖導聯(lián)上出現(xiàn)ST段弓背樣抬高為結扎成功. 生存的13動物被隨機分為2組，實驗組（M組，n1=7）于心肌梗死前后緣上、中、下各3點分別注射自體MSC 1×1011/L，對照組（C組，n2=6）注射同等數(shù)量的PBS. 4 wk后重返實驗室，麻醉方法同前. 先行心臟彩超檢查，測量左室后壁運動幅度、左室收縮期室壁增厚率及射血分數(shù)，而后分離頸動脈行左心室插管，左心室插管經(jīng)三通接八道生理記錄儀

7、之載波放大器，記錄左心室壓力曲線，左心室壓力微分曲線，記錄左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室收縮壓（LVSP）左心室壓力微分（dp/dt）： 曲線及左室壓正負變化最大速率（±dp/dtmax）.1.2.1移植MSC向心肌細胞分化的檢測測量完畢后，取心肌梗死區(qū)的組織進行冰凍切片，行免疫熒光雙標法染色確定移植骨髓基質(zhì)干細胞向心肌細胞分化. 免疫熒光雙標法：切片加2 mol/L HCl中30 min（37）， 0.01 mol/L硼酸液中和10 min，浸入含0.3 g/L Triton X100的0.01 mol/L KPBS 30 min后，首先入1100小鼠抗兔sarcomeric

8、 actin抗體4孵育24 h后，0.01 mol/L KPBS漂洗，然后入1100的FITC標記的antiBrdU抗體及1100的Cy3標記的羊抗小鼠IgG (1200的TRITC標記的羊抗小鼠IgG)，避光孵育4 h，漂洗后緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察.1.2.2Western blot分析取心肌梗死區(qū)的組織，在-80和37之間反復凍融6次，移入1.5 mL Ep管中，4，14 800 g離心15 min，取上清. 用100 g/L的SDSPAGE膠分離蛋白質(zhì)，Bradford法蛋白定量后，均取20 g總蛋白行120 g/L SDSPAGE凝膠電泳，電轉移于NC膜上，加入一抗VEGF

9、 (11000, Chemicon), bFGF (11000, Santa Cruz)，4過夜. PBST洗膜15 min×1. 將膜裝入塑料袋中，加入用PBST稀釋羊抗小鼠IgG（11000）， 37 1 h. PBST洗膜15 min×3. 放射自顯影：按照ECL試劑盒(Amersham公司)說明進行，觀察照相.            【關鍵詞】缺血心肌Autologous marrow stromal cell transplantation fo

10、r improving rabbit cardiac performa         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。1.2.3ELISA法測定局部心肌組織中VEGF的表達將局部心肌組織勻漿后以24 800 g離心.用ELISA試劑盒(Santa Cruz)檢測心肌組織中VEGF的表達.1.2.4梗死區(qū)血管數(shù)目的檢測切片經(jīng)過免疫組化染色血管標志物凝血因子. 采用

11、SABC免疫組化法染色（武漢博士德），組織切片加入小鼠抗因子mAb (Dako)在4過夜，加入生物素標記的羊抗小鼠IgG 37孵育1 h，再滴加SABC，37孵育1 h，最后用DAB顯色，蘇木素復染. 經(jīng)過免疫組化染色的微血管呈棕黃色，為了量化缺血區(qū)的血管數(shù)量，每只動物取10張切片，每張切片隨機取3個200×視野，進行血管記數(shù). 凡是免疫組化凝血因子染色成棕黃的2個或2個以上內(nèi)皮細胞簇均作為1個血管記數(shù).統(tǒng)計學處理：所有資料用x±s表示，由SPSS 10.0軟件包處理. 兩組間比較采用t檢驗，不同時間點超聲觀察指標的比較采用重復測量資料的方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計

12、學意義.    2結果在原代培養(yǎng)的MSC中，多數(shù)為成纖維樣的梭形細胞，偶有寬闊、平坦的多邊形細胞，初始細胞呈團簇生長，向四周發(fā)散. 經(jīng)換液培養(yǎng)后，造血細胞基本消失，貼壁細胞體積較大，均為一致的梭形細胞. 隨著時間的延長，細胞形成克隆樣生長，漸漸鋪滿整個培養(yǎng)瓶. 傳代后生長的細胞形態(tài)一致，均為成纖維樣的梭形細胞，有時可見細胞融合（圖1A）. 我們用BrdU標記準備移植的MSC. BrdU在細胞生長的S期標記細胞核，可見BrdU陽性的細胞核呈現(xiàn)棕黃色，還可見到核分裂像（圖1B）. 移植的MSC經(jīng)過免疫熒光雙標法顯示BrdU及sarcomeric actin(

13、connexin 43)通過Western blot檢測分析顯示移植MSC的心肌組織中VEGF和bFGF表達較對照組高（圖4），ELISA分析顯示移植MSC可促進心肌組織中VEGF表達(684±86) fg/L vs (515±51) fg/L，P<0.05. 凝血因子存在于血管壁，介導凝血反應，是血管內(nèi)皮細胞的標記物，通過免疫組化可顯示微血管內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)棕黃色（圖5）. 實驗組血管數(shù)量明顯高于對照組(22.9±6.6)/HP vs (19.0±5.9)/HP，P<0.05.從超聲心動圖上顯示左室側壁運動幅度（LVFWSD，mm）、左室收縮期

14、室壁增厚率(LVT，%)及左室射血分數(shù)(LVEF，%)在術前和移植前均沒有明顯差異. 移植后4 wk后，實驗組（M組）和對照組（C組）有明顯差異. 左室側壁運動幅度:（1.75±0.42）mm vs （1.09±0.28）mm; 左室收縮期室壁增厚率: （18.5±4.8）% vs （10.8±3.6）%; 3討論兔可提供充足數(shù)量的MSC以供移植所需2. 心肌中的微環(huán)境可以支持被移植的MSC的生長，并且可以促進MSC向心肌細胞分化3-4. 我們發(fā)現(xiàn)被BrdU標記的MSC移植到心梗區(qū)后表達出橫紋肌肌動蛋白，同時表達出存在于閏盤中的connexin 43，說

15、明分化為心肌細胞的MSC同周圍心肌細胞通過閏盤連接，同周圍宿主細胞形成功能合胞體. MSC的這種“歸巢”和表達不同組織特異性基因的能力說明組織微環(huán)境對于MSC 的分化起了重作用. 我們發(fā)現(xiàn)，移植MSC后衡量左室收縮功能的指標(LVEF, LVSP，dp/dtmax，左室后壁運動幅度和左室收縮期室壁增厚率)較對照組高，左室舒張功能指標（LVEDP和dp/dtmin）較對照組恢復好. 移植MSC后，心肌缺血組織表達bFGF和VEGF增加，而且血管數(shù)目較對照組增多. 這種不同于以前報道的同種基因大鼠之間進行的細胞移植模型5，更接近于臨床，意義更大.【參考文獻】1 Hakuno D, Fukuda K

16、, Makino S, et al. Bone marrowderived regenerated cardiomyocytes(CMG Cells) express function adrenergic and muscarinic receptorsJ. Circulation, 2002,105(3):380-386.2 Abbott JD, Giordano FJ. Stem cells and cardiovascular diseaseJ. J Nucl Cardiol, 2003,10(4):403-412.3 張勇，蔡振杰，陳如坤. 小鼠骨髓基質(zhì)干細胞定向誘導為前體心肌細胞J. 第四軍醫(yī)大學學報，2004,25(17)：1570-1574.4 吳鐵軍，蔡振杰，俞世強，等. 不同濃度5雜氮胞苷對骨髓間質(zhì)干細胞體外誘導分化的