實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測人IL9 mRNA方法的建立及應(yīng)用

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測人IL9 mRNA方法的建立及應(yīng)用 11-03-23 11:52:00 編輯：studa20 作者：楊先知 史燁 柳迎昭 陳建國 田潔 劉艷 劉青玲蘇兆亮 仝佳 馬斌 馬潔 邵啟祥 許化溪 王勝軍【摘要】 目的： 建立檢測人白介素9 (interleukin9，IL9) mRNA的SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR, qRTPCR)方法。方法： 分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，經(jīng)PMA和離子霉素刺激活化后提取總RN

2、A并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T載體連接構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。采用qRTPCR方法檢測IL9 mRNA的表達(dá)水平。評(píng)價(jià)該方法的線性及特異性，應(yīng)用該方法檢測Graves病患者PBMC中IL9 mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果： 建立了人IL9的SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。該法的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r2為0.9950.998，熔解曲線分析產(chǎn)物為單峰。Graves病患者PBMC中IL9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組(P0.01)。結(jié)論： 建立的檢測人IL9 mRNA的SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法靈敏、特異性好，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 白細(xì)

3、胞介素9; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; SYBR GreenAbstract Objective: To establish a SYBR Green based realtime fluorescence quantitative PCR (qRTPCR) method for detection human interleukin9 (IL9) mRNA expression. Method: The specific primers were designed according to the conserved sequence of human IL9 gene. Total RNAs w

4、ere extracted from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which were stimulated by PMA and ionomycin, then the RNAs were transcribed reversely into cDNAs. The plasmid standards were constructed. The sensitivity and specificity of the method were evaluated. The relative expression levels of

5、human IL9 mRNA in PBMCs from patients with Graves disease (GD) and healthy controls were detected by this method. Results: The coefficient of correlation of the standard curve of this method was 0.995-0.998, melting curve analysis showed single peak. The relative expression levels of human IL9 mRNA

6、in GD group were higher than that in healthy control group (P0.01). Conclusion: The method to detect IL9 by SYBR Greenbased qRTPCR was good in sensitivity, specificity and linear function. It can be used as a standard method of qRTPCR for detection of human IL9 expression.Key words interleukin9; rea

7、ltime fluorescence quantitative PCR; SYBR Green早先認(rèn)為IL9是由Th2細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，在抗寄生蟲感染及過敏性哮喘中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)有一種新的CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL9及IL10，稱之為“Th9細(xì)胞”, 在炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用1-3。我們建立了一種檢測人IL9 表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR, qRTPCR)方法，并應(yīng)用于Graves病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBM

8、C)中人IL9 mRNA的檢測，為進(jìn)一步研究IL9在臨床中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)手段。1 材料和方法1.1 材 料1.1.1 研究對(duì)象 Graves病患者組22例(男5例，女17例)，平均年齡(31.49.4)歲，均為經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院確診的初診患者。健康對(duì)照組20例(男5例，女15例)，平均年齡(29.610.3)歲，無慢性疾病及自身免疫性疾病。1.1.2 主要試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)、離子霉素(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)

9、，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FSK101(ToYoBo公司)，rTaq酶、dNTPs、10PCR 緩沖液、pMD18T載體、BamH 、Hind (TaKaRa公司)，熒光定量PCR試劑盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMixUDG with ROX(Invitrogen公司)，Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀(Stratagen公司)，pMD18T肌動(dòng)蛋白質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。1.2 方 法1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 利用Oligo 6.0軟件根據(jù)基因庫中IL9(NM_000590)的序列設(shè)計(jì)PCR引物。IL9：上游引物5CCAGCTTCCAAGTGCC

10、ACTGC3; 下游引物5TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG3;擴(kuò)增片段125 bp。肌動(dòng)蛋白：上游引物5CACGAAACTACCTTCAACTCC3;下游引物5CATACTCCTGCTTGCTGATC3;擴(kuò)增片段262 bp4。以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2.2 樣本處理 取5 ml肝素抗凝靜脈血，使用人淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC， 用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1106/ml，取1 ml放入24孔板，以50 ng/ml PMA和1 g/ml離子霉素于5%CO2、37刺激培養(yǎng)5 h后收集細(xì)胞，加入1 ml Trizol試劑裂解細(xì)胞，提取總RN

11、A。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo(dT)20將總RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。反應(yīng)條件：42，20 min;99，5 min;4，5 min。合成的cDNA存于-20oC冰箱備用。1.2.3 pMD18TIL9重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以上述制備的cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增IL9片段。反應(yīng)條件：94預(yù)變性5 min;94，30 s;58，30 s;72，30 s;35個(gè)循環(huán);72，7 min。將PCR產(chǎn)物與pMD18T載體進(jìn)行TA克隆，經(jīng)BamH 酶切、BamH 和Hind 雙酶切及PCR鑒定，陽性克隆送上海英駿公司測序，證實(shí)與基因庫中IL9序列完全一致。陽性克隆菌株通過LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，抽提并純化質(zhì)粒，將純化

12、質(zhì)粒稀釋成102107/l作為標(biāo)準(zhǔn)品，于-20冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)試劑盒說明：50 2 min;95 預(yù)變性2 min;95 ，15 s; 58(IL9)/56 (肌動(dòng)蛋白)，20 s;82(IL9)/86(肌動(dòng)蛋白)8 s;擴(kuò)增40(IL9)/30(肌動(dòng)蛋白)個(gè)循環(huán)。為避免引物二聚體干擾，分別在82(IL9)/86(肌動(dòng)蛋白)收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增結(jié)束后由儀器軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.5 特異性的評(píng)價(jià) 標(biāo)準(zhǔn)品及臨床標(biāo)本cDNA在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析，檢測PCR產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物，分析該方法的特異性。1.2.6 樣本IL9 mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測