水稻穎殼異常發(fā)育突變體Oseg1和Oseg2的基因圖位克隆及基因功能分析

1、單位代號：雌擘號邶，鉀上海大學碩士學位論文【蓄水稻穎殼異常發(fā)育突變體偽錨？和偽嘲的基因圖位克隆及基因功能分析作者王紅攙學科專業(yè)食品科學導師壅塞基煎絲韭大兵教授先成日期墊籩生！旦一懈碰如刪臂上海大學碩士學位論文水稻穎殼異常發(fā)育突變體和的基因圖位克隆及基因功能分析摘要利用水稻小花各輪器官發(fā)育異常的突變體來研究單子葉植物花器官發(fā)育的分子調控機制是目前植物分子遺傳學的研究熱點。本研究將粳稻品種進行射線誘變，從代突變體庫中篩到兩個穎殼發(fā)育異常的突變體，分別命名為（）和（）。在營養(yǎng)生長時期，這兩個突變體與野生型相比，沒有明顯發(fā)育異常。進入生殖生長后，花的退化穎殼（）比野生型的退化穎殼明顯增長；護穎（）和野

2、生型相比也異常增長；雄蕊數目減少。突變體的護穎也異常增長，一次枝梗形態(tài)彎曲，數量增多。利用電子顯微鏡對和的表型特征進行了細致的分析，表明和的突變影響水稻小穗頂端分生組織正常發(fā)育，造成小穗原基發(fā)育異常。分別對這兩個突變體進行的遺傳學分析結果表明這兩個性狀各受一對隱性基因控制。為了對和進行基因定位，分別將和純合體與秈稻品種廣陸矮號雜交，建立代群體，篩選代中的突變株，利用已公布的水稻系列標記及自行設計標記，應用圖位克隆技術，對和位點進行遺傳定位。我們將進行了初定位和精細定位，最終將定位在號染色體上標記與之間，遺傳距離分別為和，為進一步克隆基因和研究水稻小穗器官發(fā)育的調控機理奠定了基礎。另外，我們將精

3、細定位在號染色體上標記和標記之間，遺傳距離，物理距離的區(qū)段范圍內。對其中兩個可能與花發(fā)育相關的基因進行測序，測序結果顯示其中一個轉錄因子基因發(fā)生突變，命名此基因為。隨后，提取野生型和突變乖奉，擴增全長后測序，證明突變體中偽匹回基因內含子剪切異常，造成移碼突變。在此基礎上，我們又利用干擾的方法，證明了水稻野生型的上海大學碩士學位論文基因沉默后可以產生突變體的表型，證明確實由于基因的突變產生的表型。將基因在野生型水稻中過量表達后，我們觀察到偽段玨過量表達的轉基因植株產生了新表型：一次枝梗數目減少，小穗夕稃頂端長出刺狀器官。為研究的表達特性，我們提取了野生型水稻植株的根、莖、葉、穗、幼苗的，以瞞因作

4、參照，利用分析了在水稻生長過程中的表達情況。結果表明伽瓜刀可以在水稻根、莖、葉、穗、幼苗中表達。我們還構建了仉曰基因的原核表達載體，高效表達了蛋白，并免疫法制備了抗體。這些工作為進一步研究在水稻小穗形態(tài)建成過程中發(fā)揮的功能奠定了良好的基礎。關鍵詞：水稻（刪缸口）；護穎；退化穎殼：基因定位；功能分析上海大學碩士學位論文，（）（聊），？，）（矗），前托恤，上海大學碩士學位論文：，：（）；上海大學碩十學位論文原創(chuàng)性聲明本人聲明：所呈交的論文是本人在導師指導下進行的研究工作。除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己發(fā)表或撰寫過的研究成果。參與同一工作的其他同志對本研究所做的任何貢獻均已

5、在論文中作了明確的說明并表示了謝意。簽名：至盤拉日本論文使用授權說明瓤：瑚鑫本人完全了解上海大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留論文及送交論文復印件，允許論文被查閱和借閱；學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨热?。（保密的論文在解密后應遵守此規(guī)定）簽名：至匆二移導師簽名：搬日期：遜！：髟上海大學碩士學位論文第一章綜述：植物花器官發(fā)育的研究進展雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻的花器官結構雙子葉模式植物擬南芥，花輻射對稱，第一輪是片萼片（），第二輪為片花瓣（），第三輪為枚雄蕊（），第四輪為心皮（）所構成的復雌蕊。、單子葉植物早在億年前就和雙子葉植物開始分開進化【”，發(fā)展到今天，花器官

6、形態(tài)已經發(fā)生了很大差異。一般認為水稻穎花（）包括片外稃（）和片內稃（），對漿片（），個雄蕊（）和個心皮（）（圖，）。稃片下有一對護穎（，圖，），與穎花共同構成一朵完整的小穗（）。小穗下方還有兩片退化穎殼（，圖，）。護穎和退化穎殼相當于雙子葉植物的苞葉（）【】，其研究由于缺乏相應的突變體而受到限制。 圖擬南芥花和水稻穎花的形態(tài)比較，退化穎殼；，護穎；，稃；聘內稃；，漿片；，雄蕊；，心皮；，柱頭雙子葉模式植物花器官發(fā)育模型擬南芥是研究雙子葉植物花器官發(fā)育分子調控機理的模式植物，花由花萼、上海大學碩士學位論文花瓣、雄蕊和雌蕊輪花器官組成。通過對擬南芥突變體的研究，人們發(fā)現擬南芥中有一系列能控制花器官

7、相互轉化的基因。和一這兩個基因只要有一個缺失，花萼和花瓣就不能正常發(fā)育，花萼位置處發(fā)育出變形的雌蕊，花瓣位置處發(fā)育出雄蕊（圖，），部分發(fā)育出了新的小花和中之一發(fā)生突變都會導致花瓣轉變?yōu)榛ㄝ?，雄蕊變成心皮（圖，）。突變中，雄蕊和雌蕊無法發(fā)育，雄蕊位置處發(fā)育出花瓣，雌蕊位置處發(fā)育出花萼（圖，）。在類基因和類基因雙突變體中，類基因在各輪花器官中都具有活性，使四輪器官均變?yōu)檩嗥▓D，）。在類基因和類基因雙突變體中，類基因在各輪花器官中都具有活性，產生兩輪花瓣和兩輪雄蕊（圖，）。在類基因、類基因和類基因三突變體中，花的各輪器官都轉變成了葉狀結構（圖，）。通過對這些基因的研究，人們提出了關于花器官發(fā)育決定

8、的模型理論（圖，），來揭示雙子葉植物花器官發(fā)育的遺傳控制機理【”。即在擬南芥中，花萼形態(tài)由類基因調控，花瓣形態(tài)由類和類基因共同調控，雄蕊形態(tài)由類和類基因共同調控，雌蕊形態(tài)由類基因調控。其中，類基因和類基因的活性相互抑制，類基因抑制類基因在第一輪花器官和第二輪花器官中的表達，類基因抑制類基因在第三輪花器官和第四輪花器官中的表達【】。三類基因的活性與它們在花中的位置無關。上海大學碩士學位論文 圈根據對拉南芥同源異型突變體的研究提出了模型：（）；：（）；：（國；：（）；：（唱）；：；：；：；：金魚草也是研究雙子葉植物花發(fā)育分子控制機理的模式植物，（），（）和（）分別是擬南芥中，”，和的同源基因，模型

9、對雙子葉植物花發(fā)育的調控具有保守性。年人們從矮牽牛（）中克隆到了專地在胚珠原基、珠被和珠柄中表達的和用驢，發(fā)現了調控胚珠發(fā)育的類基因【，。過量表達，轉基因植株的第一輪花器官和第二輪花器官上形成了異位胚珠【】。抑制和表達，在野生型植株形成胚珠的地方發(fā)育出心皮狀或形似葉狀的結構，命名為功能基因。之后，人們在擬南芥中克隆到了與上海大學碩士學位論文和只爐行使相同功能的基因，證明了類基因在雙子葉植物中的保守性。此后，這樣經典模型被擴展為模型。一如果說類基因對花發(fā)育是充分條件的話，那么在任何器官中將類基因表達，都應該能夠產生花的表型。事實上，人們將類基因在葉中異位表達，無法產生花的器官【”】。因此，類基因

10、對花發(fā)育只是必要條件，不是充分條件。所以還存在著其他未發(fā)現的花誘導必需因子。后來，在年人們通過尋找能夠與模型中的蛋白相互作用的蛋白的方法，發(fā)現了參與花瓣、雄蕊和雌蕊輪器官發(fā)育的類基因【，類基因由艇（也）、（也）、（也）和（也叫上）組成，彼此之間存在功能冗余。類基因與、和類基因共同作用，參與花器官的發(fā)育調控。至此，四因子模型應運而生（圖）。該模型假設種花同源異形基因的不同組合決定不同花器官的特征。蛋白復合物一一？一？決定萼片形成，卜決定花瓣形成，一決定雄蕊形成，決定心皮形成（圖），這些蛋白質復合物通過粘著在特異目標基因的啟動子上激活或抑制不同的器官特征基因發(fā)揮功能。不同蛋白質復合物和序列之間親合

11、力的不同和不同基因啟動子區(qū)域的不同決定了蛋白質復合物和目標基因的相互選擇。上海大學碩士學位論文 圖控制雙子葉植物花器官發(fā)育的模型【引自】上海大學碩士學位論文值得注意的是，除了一朋，控制雙子葉植物花器官發(fā)育的模型中的這些基因都有一個命名為域的保守的結合域，屬于基因家族的成員。調控單子葉植物花器官發(fā)育的分子機理的研究進展通過研究水稻中一些與雙子葉植物模型基因同源的盒基因，人們已經克隆了一些與水稻花器官發(fā)育相關的基因，初步分析了控制水稻花器官發(fā)育的分予機理。類基因：水稻中與相似性最高的基因是（也叫刪儺，）【“，特異在幼嫩花序及小穗分生組織中表達。小穗器官分化后，在內外稃和漿片中表達，在護穎中也有微弱

12、表達。（也叫、）和（也叫）】與序列相似性也很高【。在水稻小穗所有部位都表達，小穗成熟后，在漿片和穎片中檢測不到其表達。起初在穎片、內外稃中表達，小穗成熟后，只在雄蕊和心皮中檢測到表達【。盡管和與序列相似性很高，表達模式卻大不相同。姒列鉗表達模式與五，相似，還需要功能分析來確定是否一朋在水稻中的同源基因。早期在花原基各處表達，后期只在內外稃和胚珠中表達，突變體內外稃和漿片轉化成葉狀，部分小穗產生了新的小花【”，說明有花分生組織決定作用。這個表型與相似，但是是否是類基因仍然需要鑒定。類基因：根據序列相似性，和是，是【。研究證實，（突變體命名為）和可以調控水稻花的漿片和雄蕊的特征，類基因在雙子葉植物

13、和單子葉植物進化過程中的保守性已經被證明講，圈，漿片被認為與雙子葉植物中花瓣同源。類基因：研究證明，姒糾野（也叫刪）在只在雄蕊和雌蕊中表達，調控雄蕊和心皮的特征，屬于類基因瞄。類基因在雙子葉植物和單子葉植物中是保守的。在胡突變體中，心皮被同源異型轉化為雄蕊。在花發(fā)育中，基因的表達開始于心皮原基起始的區(qū)域，并且在心皮原基中持續(xù)表達。因此，上海大學碩士學位論文基因僅特化一輪花器管的特性。從這個方面講，模型在水稻中被修改了。近期研究證明，單子葉植物和雙子葉植物分開進化后，類基因在單子葉植物中發(fā)生了復制，功能分離，和在水稻中共同行使了類基因功能剛。類基匿亂與和具有序列相似度叨，表達方式相似，在胚珠和心

14、皮內層表達。與和一樣，能夠結合特異基因，來行使基因功能。說明類基因行使基因功能的方式在雙子葉植物和單子葉植物中是保守的。類基因：系統(tǒng)進化分析顯示，（也叫）、（也叫）、仇朋腳、與基因同組，親緣關系較近田】，最近的是和，早期在漿片和雄蕊原基分生組織中表達，后期在漿片、雄蕊和雌蕊原基中表達，是類基因在水稻中的候選基因。由于具有分生組織決定性，也是類基因在水稻中的候選基因?！薄；蚣易宄饲鸫?，幾乎所有基因都是高度保守的，含有保守結構域，屬于基因。來自，及蛋白的首字母。是酵母細胞類型的調節(jié)因子，是酵母精氨酸代謝基因的調節(jié)因子，與勻是花器官類別基因產物，則是人血清應答因子（）。和兩個結合蛋白均識別靶序列

15、（】。該序列編碼一個與特定序列結合的轉錄因子功能的結構域。對于維管植物而言，基因編碼的轉錄因子具有保守結構特性，也稱之為切結構域【，即包括，（），（）和（）域。（）結構域是由個氨基酸殘基組成的高度保守的區(qū)域，是與結合的主要決定因素。它形成二聚體調節(jié)與的結合。該區(qū)域可部分的折疊，形成由螺旋所形成的反向平行的螺旋卷曲螺旋，平躺于的小溝中。它識別（特征序列，該序列稱為（），它存在于許多基因的啟動子區(qū)域內，因此蛋白上海大學碩士學位論文可能通過對（的調控來調節(jié)基因的轉錄。（）結構域是一段約個氨基酸殘基的片段，與角蛋白（）部分同源，至今在動物和真菌中還未被發(fā)現。二級結構分析表明結構域含有個螺旋，和，與疏水

16、殘基有保守的整齊間距，能在蛋白二聚體中形成兩親和性螺旋結構，調解蛋白質之間的相互作用。（）在結構域和區(qū)域之間存在一段個氨基酸的區(qū)域，含有較多親水殘基的非保守區(qū)域，幫助轉錄因子蛋白二聚體與結合形成復合體。（）結構域下游的非保守的端主要由疏水氨基酸組成，約個氨基酸長度的富含疏水殘基的非保守區(qū)域，可能作為基因的轉錄激活區(qū)域，與多聚體高級結構有關【】。編碼具有這些區(qū)域的基因被稱為型基因。此外，在少數區(qū)上游還有一個延伸的區(qū)，具有這種結構的基因被稱為型。如人的在區(qū)前就有一段較長的延伸區(qū)。通過對人的。射線晶體衍射研究發(fā)現，的兩個單體以二聚體形式結合在一起，核心區(qū)由結構域個氨基酸和延伸的約個氨基酸組成，二聚體

17、分成三個結構單元疊加在一起。第一個結構單元是結合區(qū)，由分別來自兩個單體的旺螺旋形成的一個反平行的螺旋卷曲螺旋。這兩個螺旋平行于其識別的的雙螺旋的小溝，并與的磷酸骨架接觸，分子包裹在螺旋卷曲螺旋的周圍，兩個螺旋的鏈端即兩個單體的段插入的雙螺旋的小溝內和分子相結合。第二個結構單元式四段反平行的折疊，由結構域端和延伸的一段氨基酸組成（對應于植物蛋白區(qū)）。第三個結構單元即頂部，位于折疊上方，是由一個不規(guī)則的螺旋卷曲螺旋緊接著一個短的螺旋組成。由于，和在此部分結構相似，又稱之為結構。由于結構與在氨基酸組成上的高度相似性，對作用機理的分析也同樣適用分析植物中的蛋白。等發(fā)現，植物結構組成在功能上的分配也是和

18、相似的：端進行結合，端主要起到形成二聚體的作用，區(qū)寸蛋白形成二聚體是必不可少的。水稻花序原基分化過程植物發(fā)育的模式與動物相比具有顯著的差異。在動物的個體發(fā)育過程中，其形態(tài)的建成發(fā)生在胚胎發(fā)生階段（），與器官形成相關的細胞分上海大學碩士學位論文裂和分化活動集中出現在這一階段。在胚后的發(fā)育階段，雖然仍然有細胞分裂和分化的發(fā)生，但這些細胞的分裂和分化的作用主要是維持器官的正常功能。而植物的形態(tài)建成主要通過分生組織（）的分裂和分化活動，在一個相當長的時期內完成。分生組織是一群未分化的、不斷分裂的細胞。在植物的胚胎發(fā)生階段，植株就形成了根端分生組織（）和莖端分生組織（），在胚胎發(fā)生后的發(fā)育過程中，頂端分

19、生組織不斷的分化形成新的側生器官】。一方面，分生組織能夠根據外界環(huán)境的刺激及內部遺傳因子的控制，不斷的分化出根、莖、葉、枝、花等器官，以保證植物能夠完成整個生命周期；另一方面，分生組織能夠不斷的分裂，以填補由于器官形成過程中所消耗的細胞，以保持自身的完整性【】。營養(yǎng)生長階段，莖端分生組織不斷分化產生葉原基（圖，）。進入生殖生長后，莖端分生組織分化產生初級枝梗分生組織（圖，）。之后，初級枝梗分生組織分化產生小穗枝梗分生組織（也級枝梗分生組織）、終端穗分生組織和側生穗分生組織（圖，），穗分生組織分化產生小穗原基。小穗原基依次分化產生外退化穎原基、內退化穎原基、外護穎原基、內護穎原基、外稃原基和內稃

20、原基（圖，）。原基逐漸發(fā)育成器官，內外稃閉攏，包住內部花器官，形成完整小穗（圖，）。一個發(fā)育成熟的水稻花序示意圖見圖，。上海大學碩士學位論文贏：虢融：翼蜘圖水稻莖端分生組織（）發(fā)育示意圖【引自叻葉原基；，初級枝梗分生組織；，既終端穗分生組織；，側生穗分生組織；，穗枝梗分生組織；，化穎；，內退化穎；護穎；，啪內護穎；，稃；，內稃；，主軸；，初級枝梗；，二級枝梗；，終端穗；，側生穗；卻，退化點趴上海大學碩士學位論文第二章控制水稻護穎發(fā)育的基因的圖位克隆及功能分析材料和儀器水稻材料的種植及突變體來源用”射線誘變粳稻種子，處理劑量為。在代分離群體中獲得一株穎殼異常發(fā)育的突變體，將該突變體與野生型回交代

21、，獲得隱性單基因控制的的突變體。所有植物材料種植于上海市農業(yè)科學院實驗基地。突變體的遺傳分析和定位群體的構建將突變體與秈稻品種廣陸矮號雜交，獲得代。代自交獲得代，大田種植，出現表型后，選擇其中的突變植株作為定位群體。本研究中篩選到定位群體抹。水稻植株的表型觀察大田種植植株。待植株抽穗后，對野生型和突變體進行觀察拍照。實驗試劑及配方本實驗所用的引物由上海博亞（英駿）生物工程技術服務有限公司合成。、和等購自公司。水稻培養(yǎng)基購自。其余試劑為國產分析純產品。（）（）（）（）氯仿：異戊醇氯仿：異戊醇的體積比為：（）聚丙烯酰胺母液丙烯酰胺，一亞甲雙丙烯酰胺尿素×加水至（）硝酸銀染色液在毫升水中加

22、入硝酸銀。（）顯影液在水中加入：四硼酸鈉甲醛（）固定液無水乙醇冰醋酸甲醛水（）基礎培養(yǎng)基：母液：大量元素（）母液：）（鈣鹽（）。母液：鉀鹽（）。母液：微量元素（）。、。母液：×維生素（）甘氨酸鹽酸硫胺素鹽酸吡哆素煙酸肌醇母液：鐵鹽（）配制培養(yǎng)基時分別加入母液、各，母液、各和母液，另加入蔗糖，調節(jié)值至，高壓滅菌（固體培養(yǎng)基加的瓊脂）。（）：在基礎培養(yǎng)基中添加以下物質：干酪素蔗糖，調節(jié)值至，高壓滅菌。上海丈學碩士學位論文（）：除了，的濃度為外，其余同。（）血液體培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中添加：干酪素扎蔗糖，（乙酰丁香酮）洲調節(jié)值至，高壓滅菌。（）：中加入“乙酰丁香酮。（）：中加入的頭孢氨芐，

23、）的潮霉素。（）：中加入的頭孢氨芐，的潮霉素。（）：在含有的水（滅菌）中添溶液溶液溶液頭孢氨芐舡潮霉素（）：在基礎培養(yǎng)基中添加：干酪素玉米素（）上海大學碩士學位論文激動素頭孢氨芐潮霉素蔗糖山梨醇調節(jié)值至，高壓滅菌。（）：在基礎培養(yǎng)基中添加：干酪素潮霉素頭孢氨芐蔗糖幾調節(jié)值至，高壓滅菌。（）檢測試劑封閉緩沖液：，：調節(jié)?，F配現用：取絡，加在皿水中，取止用稀釋至。每孔加皿。（）配制甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠所用溶液：成分配制不同體積和濃度凝膠所需各成分的體軎膠水丙烯酰胺混合液幾上海大學碩士學位論文，過硫酸銨膠水丙烯酰胺混合液（過硫酸銨功，配制甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠所用溶液：成分配制不同

24、體積和濃度凝膠所需各成分的體積，水丙烯酰胺混合液過硫酸銨（）×一甘氨酸緩沖液（）堿甘氨酸（電泳級）（）（）×凝膠加樣緩沖液（電泳級）溴酚藍甘油（）考馬斯亮藍染色液考馬斯亮藍甲醇冰醋酸上海大學碩士學位論文（）考馬斯亮藍脫色液甲醇冰醋酸實驗儀器型擴增儀（）型電泳槽（北京六一儀器廠）型電泳儀（北京六一儀器廠）型，高速冷凍離心機（德國公司）移液器（）冰箱（）。冰箱（）冰箱（微波爐）基因導入儀（寧波新芝科器研究所）潔凈工作臺（上海博迅有限公司醫(yī)療設備廠）型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）恒溫振蕩器（江蘇太倉市試驗設備廠）解剖鏡（型脫色搖床（上海琪特分析儀器有限公司）電子天平

25、（￥型離心機（型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅有限公司醫(yī)療設備廠）制冰機（）自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）上海大學碩士學位論文實驗方法法提取水稻總根據公布的提取水稻總的方法【“，稱左右的水稻葉片放入小研缽，加入適量的液氦，立刻研磨至粉末，放入的管中，可暫時保存在。中。加入止的的溶液于前離心管中，小心混勻后放入水浴搖床，搖床頻率為。后取出離心管，加入等體積氯仿：異丙醇，猛烈搖勻，離心，。取上清（注意不要帶入氯仿）于備好的新管中，加入倍體積的預冷的異丙醇（或倍的無水乙醇），先緩慢混勻，再猛烈混勻幾下，使成團，放入以上。將析出的離心。棄上清，將沉淀用的乙醇洗

26、滌一次，離心后干燥。將沉淀溶于此或超純水中。分子標記分析標記根據已發(fā)表的序列合成：）。標記的設計是根據已發(fā)表的粳稻日本晴和秈稻【刀兩品系的核苷酸序列，將粳稻與秈稻的克隆序列進行比較，在差異序列兩側利用軟件設計引物，然后驗證在個親本粳稻和秈稻廣陸矮號之間的多態(tài)性。程序參考蜘等人的方法【司做了部分調整。此的反應體系中包括：州的引物，州，×（，膠），的模板，的酶。反應程序為：預變性，循環(huán)（，）次，最后延伸。聚丙烯酰胺變性凝膠電泳和銀染采用的變性電泳和銀染的方法染色，。擴增產物用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳。包括以下三個基本操作步上海大學碩士學位論文驟。制膠：聚丙烯酰胺變性膠的配制方法是：取丙烯酰

27、胺母液，加入的過硫酸胺，此，攪勻，立即注膠；注滿后，放平玻璃板，使其與桌面成左右的角度，插入梳子；靜放個小時。點樣：待膠完全凝固后，小心拔出梳子，用蒸餾水反復沖洗點樣孔，清除多余沒有凝固的物質；將玻璃板固定在垂直電泳槽上，加入適量的×緩沖液；取擴增產物，每管加入此含溴酚藍和二甲苯氰兩種指示劑的載樣緩沖液，用微量進樣器取止，樣品注入點樣孔。電泳：調電壓至，電泳時間約為。電泳完畢后，將玻璃板從電泳槽上拆下，取出凝膠，在蒸餾水中漂洗兩次，每次約；轉入溶液中，在搖床上輕搖，染色：然后將凝膠轉移到蒸餾水中漂洗兩次；最后轉入顯影液中顯色，著色后轉入水中保存。凝膠成像，數碼相機拍照記錄結果。群體分

28、離分析方法根據公布的群體分離方法（，）】，從分離群體中隨機取個樣品取等量葉片混合提取構建一個突變池（或者分別提取然后取等量混合），以突變池為模板，用覆蓋基因組的分子標記進行擴增反應，同時擴增兩親本和雜交代模板作為對照。在突變池中與突變基因連鎖的座位的遺傳背景偏向突變體來源的親本，通過凝膠分析可以看出，突變體來源的親本條帶和對照相同，而用于雜交的另一親本條帶沒有或弱于對照。連鎖分析根據公布的連鎖分析方法，用篩選出來的多態(tài)性分子標記對定位群體中的突變株進行基因型分析，利用構建目標基因區(qū)域的分子標記的連鎖圖譜。上海大學碩士學位論文掃描電鏡觀察掃描電鏡的觀察參考等人的方法作了部分調整【】。（）材料固定

29、：固定液固定樣品，小時以上。（）材料脫水：，乙醇梯度脫水，每級，脫水劑體積高于材料的倍。（）臨界點干燥。（）上銅臺：將樣品用導電膠固定于銅臺上，并將樣品調整至適于觀察的位置。（）樣品噴金。（）掃描電鏡觀察。水稻的幼胚轉化及組織培養(yǎng)水稻幼胚轉化及組織培養(yǎng)參照【和等人的方法作了部分調整。（）幼胚材料的預處理采集受粉后一天未成熟的種子，在這個時期的胚乳相對固化，但仍成乳狀。將去殼種子在乙醇中浸泡后，在漂白劑（含）中滅菌。無菌水洗次。在無菌條件下有手術刀和鑷子解剖幼胚。將幼胚直接轉入培養(yǎng)基平板中。暗培養(yǎng)天。當黃色愈傷組織在胚軸出現時（通常需要四天，在這期間，根通常有長），切除根部和胚乳，將胚軸轉移至一個新鮮的培養(yǎng)基平板，鈍形面向下。暗培養(yǎng)天。（）挑取農桿菌單菌落，在加卡那霉素的培養(yǎng)基基中震蕩培養(yǎng)約（，），至為。（）離心，在液體培養(yǎng)基中重懸沉淀至濃度為。（）將個帶有黃色愈傷的胚浸泡在細菌懸液中，間或震蕩。（）從懸液中收集胚，在兩張無菌濾紙間吸干。（）在培養(yǎng)基平板表面放上無菌濾紙，把胚放在濾紙表面，暗培養(yǎng)天。（）把胚的根部去掉，把胚放入培養(yǎng)基平板上，切割面向下，暗培養(yǎng)天。（）再轉入新鮮的的培養(yǎng)基平板上暗培養(yǎng)天。在這個時間可以看見新的愈傷長出。（）把抗性愈傷（將抗性愈傷從胚上切下）放在預分化培養(yǎng)基（）平板上海大學碩士學位論文上，暗培養(yǎng)天。（）把愈傷放在生芽培養(yǎng)基培養(yǎng)基平板上，（小時光照，