異基因造血干細胞移植后受者骨髓的間充質(zhì)干細胞來源研究(1)

1、    異基因造血干細胞移植后受者骨髓的間充質(zhì)干細胞來源研究(1)    】 為了研究造血干細胞移植植活患者骨髓源間充質(zhì)干細胞（MSC）的來源，選擇臨床上供受者性別不同的造血干細胞移植后臨床植活的34例患者作為研究對象，抽取骨髓，進行間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)傳代，利用流式細胞術(shù) (FCM) 檢測患者MSC的表面抗原表達特征，利用聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 分析患者MSC的釉基質(zhì)基因表達情況以確定其性別來源，利用熒光原位雜交 (FISH) 技術(shù)進一步證實患者MSC的性別來源。結(jié)果表明：34例患者中有31例患者的MSC原代培養(yǎng)能

2、達到融合，其中24例患者成功傳代5代以上，且可進行PCR及FISH檢測；FCM結(jié)果顯示，第5代MSC的CD14 CD45 細胞表達低于0.04%；PCR結(jié)果顯示，移植后患者的MSC源于患者本人；FISH結(jié)果顯示，移植后患者的MSC 100%源于患者本人。結(jié)論：造血干細胞移植后患者骨髓中的MSC仍源于患者本人。 【關(guān)鍵詞】 造血干細胞移植Origin of Mesenchymal Stem Cells in Bone Marrow of Patients after Allogeneic Stem Cell TransplantationAbstract   

3、60;The aim of this study was to investigate the origin of bone marrow-derived mesenchymal cells in 34 patients who had received a sex-mismatched hematopoietic stem cells transplant (HSCT).The mesenchymal stem cells (MSC) from 34 patients were collected for test.The different passage MSC of patients

4、were analyzed by flow cytometry (FCM) to reveal the cell surface antigen expression.The polymerase chain reaction (PCR) analysis of the amelogenin (AMEL) genes was used to detect donor cells from host cells.The cultured MSC were stained by fluorescence in situ hybridization (FISH) probes for chromos

5、omes X (Xp11.1-Xq11.1) and Y (Yq12) to distinguish donor cells from host cells.The results indicated that 31out of 34 cases showed the confluent stroma and 24 out of these 31 cases were successfully passaged for more than 5 generations which could be used for PCR and FISH analysis.According to FCM r

6、esults the number of CD14 CD45 cells，which was regarded as monocyte/macrophage from the cultured MSC (passage 5) was less than 0.04%.In PCR assay，the marrow-derived MSC from the passage 5 were found to be of host origin. FISH assay demonstrated that marrow-derived MSC from the passage 5 were found t

7、o be of host origin up to 100%.It is concluded that the origin of MSC in bone marrow of patients after allogeneic stem cell transplantation was confirmed to be derived still from the recipients their own.Key words    hemotopoietic stem cell transplantation; allogeneic hemotopoiet

8、ic stem cell transplantation; mesenchymal stem cells源于人骨髓的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC），占骨髓中有核細胞的0.01%-0.001%。從骨髓中分離出的MSC能在體外大量擴增且具有自我更新的能力1。MSC能產(chǎn)生多種細胞因子、化學(xué)因子及細胞外基質(zhì)蛋白，在造血細胞的生長、成熟、歸巢及增殖中均具有重的作用2-5。在異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)臨床植活的患者中MSC是否為供者植活一直存有爭議6-

9、11，目前對SCT后患者MSC的來源問題尚無定論。本研究選擇臨床上供受者性別不同的allo-HSCT后臨床造血植活的34例患者作為研究對象，對allo-HSCT后造血植活患者中骨髓源的MSC的植活來源，進行了研究。材料和方法病例病例來自北京大學(xué)人民醫(yī)院或北京道培醫(yī)院，為供受者性別不同、造血植活的allo-HSCT患者共34例，其中男性17例，女性17例，年齡介于16至48歲之間。預(yù)處理包括馬利蘭（busulfan，Bu）/環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）或Bu/CTX加抗胸腺細胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）。造血干細胞來源為：骨髓移植者3例

10、，動員的外周血干細胞移植者2例，骨髓加動員的外周血干細胞移植者19例，骨髓加動員的外周血干細胞再加第三者臍血混合移植者10例。移植后給予的免疫抑制劑：氨甲喋呤（methotrexate，MTX），霉酚酸酯（mycofenolate mofitile，MMF）及強的松等。利用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)分型及短串聯(lián)重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（short tandem repeat-polymerase chain reaction，STR-PCR）等方法進行造血植

11、活及嵌合分析（附表）。Table.Characteristics of 34 patients received HSCT（略）MSC的分離及純化對患者及供者行髂后上棘穿刺抽取骨髓血10 ml，骨髓用PBS (0.01 mol/L，pH 7.4)11稀釋后，Percoll（比重1.073 g/ml）900×g梯度離心30分鐘，離心后收獲分離的單個核細胞，用DMEM-LG洗2次，以1.4×105 /cm2的細胞密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基DMEM-LG（Gibco BRL life Technologies，USA）含10% FBS，在37，5% CO 2條件下孵育。每

12、3天全量換液，待細胞長至85%至90%融合時，用0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA (Gibco BRL life Technologies，USA) 37條件下消化3-5分鐘，以1.3×104/cm2的密度在T-75瓶中進行傳代培養(yǎng)。每次傳代均更換新培養(yǎng)瓶。流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析不同代數(shù)MSC用0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA消化，配制成1×106/ml的細胞濃度，與CD14-PE，CD45Per-CP，CD44-FITC，CD29-APC(BD Biosciences，USA)避光孵育15分鐘，用PBS（ 含2%

13、血清白蛋白）洗滌2次后，以PBS懸浮或1%多聚甲醛固定待上機。對照采用IgG1-PE，CD45-Per-CP，IgG2b-FITC，IgG-APC。每次上機( FACS BD Biosciences，USA)分析10 000個細胞，使用CellQuest 軟件 (BD Biosciences，USA)進行數(shù)據(jù)分析。釉基質(zhì)基因分析通過單步PCR反應(yīng)擴增釉基質(zhì)基因（amelogenin，AMEL）可同時分辨男性或女性細胞來源12，電泳后女性細胞形成單條977 bp的條帶(AMGX)，而男性細胞形成2條977 bp (AMGX)及788 bp (AMGY)的條帶，第5代患者MSC懸浮于PBS中，使用

14、DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek，Inc.)進行DNA抽提。每個DNA樣本進行PCR擴增，使用的探針為：探針A: 5-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3，探針B: 5-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3 ；探針C: 5-GCCCAAAGTTAGTAAT-TTTAC-3 。PCR的最終反應(yīng)體系30    l，包括：250 ng DNA，每種探針30 pmol，250 mmol/L dNTPs，2.5 U Taq DNA 聚合酶 (Sangon，Shanghai.China)，2.5 l 10×PCR

15、 緩沖液（50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2），首先進行95預(yù)變性3 分鐘，PCR反應(yīng)包括94 1分鐘，60 2分鐘，72 2分鐘，共30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物采用含0.5 g/ml溴化乙錠的1.5% 瓊脂糖凝膠電泳顯影。            【摘】為了研究造血干細胞移植植活患者骨髓源間充質(zhì)干細胞（MSC）的來源，選擇臨床上供受者性別不同的造血干細 &

16、#160;       本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。熒光原位雜交分析使用CEPX spectrumOrangeTM/Y spectrumGreenTM DNA探針試劑盒(Vysis inc.USA)進行FISH分析，以分辨男性或女性細胞。第5代患者MSC用甲醇：冰醋酸固定滴片，用70%甲酰胺2×SSC進行標(biāo)本DNA變性，73，5分鐘，室溫下不同濃度乙醇脫水，加10 l探

17、針后，42過夜，次日0.4×SSC及2×SSC/0.1% NP-40洗脫，10 l DAPI復(fù)染核，使用熒光顯微鏡（Olympus BX-61，Japan）進行觀察，每個樣本計數(shù)500個細胞。ProbeChekTM 玻片(Vysis inc，USA)作為陽性對照。結(jié) 果MSC的生長及傳代能力34例患者MSC培養(yǎng)后31例(91.1%)均達到了融合；1例(2.9%)達到部分融合，2例(5.9%)未達融合，后3例患者均為臨床上造血恢復(fù)極差的患者；24例患者MSC能成功傳代5代以上，且可進行PCR、FISH分析。患者MSC的富集及鑒定在MSC的培養(yǎng)過程中，通過全量換液去除淋巴細胞，

18、而如何去除骨髓基質(zhì)中的混有的單核-巨噬細胞是非常重的，因為巨噬細胞也是黏附細胞并能成為基質(zhì)層的一部分13。本研究利用 0.25% 胰酶-1 mmol/L EDTA反復(fù)消化細胞以最大限度去除巨噬細胞，因為巨噬細胞對0.25% 胰酶-1 mmol/L EDTA不敏感，每次傳代我們都更換培養(yǎng)瓶以進一步去除瓶壁上對此酶不敏感而未消化下來的巨噬細胞。FCM檢測結(jié)果顯示，患者各代CD44 CD29 CD45-CD14-細胞比例不同，0、2、3、4、5、6、9和16代CD44 CD29 CD45-CD14-細胞依次為32.47%±1.54，90.34%±2.11、95.23%±

19、2.34、95.13%±0.93、96.68%±1.53、95.12%±3.28、92.19%±3.12和80.56%±4.23。CD44為黏附分子，CD29屬整合蛋白家族，CD14、CD45為造血細胞表面分子，CD14為巨噬細胞相對特異性表面抗原，這說明所培養(yǎng)的細胞絕大多數(shù)為易貼壁的MSC，混有的巨噬細胞不多，我們選擇第5代MSC用于PCR及FISH分析，其中CD44 CD29 細胞占（98.41±0.91）%，CD14 CD45 細胞占（0.039±0.02）% (圖1)，這表明用于PCR及FISH分析的第5代MSC中，

20、混有的單核-巨噬細胞數(shù)極低（0.039±0.02）%，低于PCR及FISH檢查的敏感度（3%及1%）10?；颊進SC的植活嵌合分析對第5代MSC細胞我們進行了位于性染色體上的AMEL基因檢查。AMEL是釉質(zhì)母細胞分泌的一種基質(zhì)蛋白，AMEL基因位于人類X和Y性染色體上，編碼一種高度保守蛋白，女性（XX）有2個相同的AMEL等位基因，而男性（XY）有2個不同的AMEL等位基因12，14-16。電泳結(jié)果顯示，女性為1個977 bp的單條帶，而男性則為788 bp和977 bp處兩個不同的條帶。本研究PCR結(jié)果顯示：臨床上造血植活的患者，其骨髓第5代MSC來源于患者本人(圖2)。 

21、;   對第5代MSC細胞利用雙色熒光DNA探針進行了FISH 檢查，CEP X DNA探針 (位于DXZ1區(qū)) 是位于X 染色體上(Xp11.1-Xq11.1)AT集中區(qū)的一個微衛(wèi)星DNA序列，熒光標(biāo)記為橘黃色，CEP Y DNA 探針(位于DYZ1區(qū)) 是位于Y 染色體上Yq12區(qū)域的一個特異性的微衛(wèi)星DNA序列，熒光標(biāo)記為綠色。在熒光顯微鏡下觀察：女性細胞的細胞核中顯示2個相同的橘色熒光標(biāo)記，而男性細胞的細胞核中顯示1個橘色熒光標(biāo)記，1個綠色熒光標(biāo)記。本研究的FISH結(jié)果顯示，臨床上造血植活的患者，其骨髓培養(yǎng)擴增第5代MSC100%來源于患者本人(圖3)。討

22、論Allo-HSCT越來越廣泛地用于造血系統(tǒng)及非造血系統(tǒng)疾病的治療中，而骨髓中的造血微環(huán)境與細胞外基質(zhì)構(gòu)成了骨髓的空間結(jié)構(gòu)，其功能是否正常對于allo-HSCT之后的造血重建起著至關(guān)重的作用17-19。allo-HSCT后造血植活的患者，其基質(zhì)細胞的來源存在爭議。Keating等6報告了14例患者，發(fā)現(xiàn)隨著移植后時間的推移，患者的基質(zhì)細胞逐漸轉(zhuǎn)為供者源的；Simmons等7報告同胞HLA配型相合的10例患者，證明患者的基質(zhì)細胞均為患者源的；Tanaka等8報告11例患者，其中7例患者的基質(zhì)細胞均為患者來源，而4例患者的基質(zhì)細胞顯示了以患者為主的混和嵌合體； Koc等9證實移植后的患者 MSC源

23、于患者；Cilloni等10報告11例去T細胞異基因HSCT患者，證明患者的基質(zhì)細胞存在混和嵌合體； Awaya等11報告了4例患者，證明患者的基質(zhì)細胞均為患者源的。        因此目前對allo-HSCT后患者MSC的來源問題沒有定論，雖然大多數(shù)結(jié)論傾向于allo-HSCT后患者的MSC源于宿主本身，但縱觀起來，這些研究還存在一些問題，比如對所研究的MSC沒有進行有目的的純化及鑒定，以去除可能混雜的巨噬細胞的影響6-9。盡管有些研究考慮到了巨噬細胞的影響，但其研究結(jié)果并不一致10，11。故關(guān)于這方面的研究有必

24、進一步進行下去，以明確allo-HSCT后患者MSC的來源，利于指導(dǎo)臨床上的allo-HSCT的相關(guān)治療，為是否在allo-HSCT過程中聯(lián)合輸注MSC提供理論依據(jù)。    本研究共分析了34例allo-HSCT患者，其中24例患者進行了PCR及FISH分析，結(jié)果證實其MSC均為患者源的。我們選擇AMEL基因作為性別鑒定的方法之一，與單純擴增Y染色體上的基因鑒別性別相比，其優(yōu)勢在于：檢測方法同樣簡便、靈敏、準(zhǔn)確，甚至可檢測出僅1個細胞或部分降解的DNA 樣本20，具有臨床實用價值。X 特異性片段同時可做為內(nèi)對照，防止由于Y 擴增產(chǎn)物的缺失而做出錯誤的結(jié)論

25、。選擇AMEL基因作為性別鑒定的方法，不論男或女，受檢樣本DNA如何，均可得出擴增產(chǎn)物，檢測結(jié)果不受Y 染色體正常變異的影響，若檢測不到擴增產(chǎn)物即意味著擴增失敗。這一方法可防止由于試驗操作過程任一環(huán)節(jié)失誤或Taq 酶缺乏等因素而造成的假陰性結(jié)果。我們選擇雙色間期FISH 分析MSC分裂間期細胞，與單色FISH比較，也避免了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，同時結(jié)果非常客觀且直觀。    關(guān)于供者MSC沒有植入的原因考慮有以下幾個方面：首先，預(yù)處理方案沒有完全清除患者的骨髓MSC以便供者的MSC植入。其次，供者的骨髓移植物中MSC含量太低（2-5 MSC/ 1×

26、106單個核細胞）也使供者的MSC不易植入21。第三，不同的輸注途徑和方法可能會影響MSC的植入； Richard等22在對1例重疊綜合癥的病人進行骨髓移植后，同時將從供者髂嵴獲得的骨碎片進行腹腔內(nèi)注射和直接注入受者的髂嵴，13 天后再靜脈輸入體外培養(yǎng)擴增的來自供者骨碎片的成骨樣細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病人移植后1年骨髓黏附細胞66%、外周血細胞89%為供者來源，2年的時候，呈現(xiàn)95% 的嵌合，并且自身免疫病有顯著改善。這一研究在證明基質(zhì)前體細胞可以植入的同時，也提示不同的輸注途徑和方法可能會影響MSC 的植入。第四，患者原發(fā)性的基質(zhì)缺陷也有助于供者基質(zhì)植入，在Horwitz等23的一項研究中提示，如果

27、正常的供者基質(zhì)細胞和異常的宿主基質(zhì)細胞相比處于競爭優(yōu)勢，它們就能夠植入。在此項研究中，33名成骨缺陷的病人在接受常規(guī)骨髓移植后，有2人檢測到供者來源的成骨細胞?；谝陨系姆治?，補充輸入供者MSC應(yīng)有利于供者MSC在患者骨髓中植入。            【摘】為了研究造血干細胞移植植活患者骨髓源間充質(zhì)干細胞（MSC）的來源，選擇臨床上供受者性別不同的造血干細         本篇論文是由3COME

28、文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    總之，本研究結(jié)果顯示：allo-HSCT后臨床上造血植活患者的MSC均源于患者本身，而患者的MSC逆轉(zhuǎn)為供者來源是否對患者有益，補充輸入供者MSC是否確實能使供者MSC在患者中植入尚需進一步的研究?！緟⒖嘉墨I】1 Reyes M，Lund T，Lenvik T， et al. Purification and ex vivo expansion of postnatal human m

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