淺談涼血活血法對(duì)肺纖維化小鼠羥脯氨酸和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1含量的影響

1、淺談涼血活血法對(duì)肺纖維化小鼠羥脯氨酸和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1含量的影響 作者：胡靜,郭永潔,劉旭凌,符勝光,龐慧芳 【摘要】 目的 研究涼血活血法防治肺纖維化的作用,并探討其作用機(jī)制。方法 將雄性icr小鼠隨機(jī)分為4組：陰性對(duì)照組、肺纖維化模型組、涼血活血法組、強(qiáng)的松陽(yáng)性對(duì)照組。經(jīng)鼻滴入博萊霉素建立小鼠肺纖維化模型,造模8 h開始常規(guī)灌胃給藥。應(yīng)用涼血活血法(犀角地黃湯)防治28 d后進(jìn)行取材及實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)：用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定支氣管肺泡灌洗液(balf)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1(tgf-1)含量變化,用樣本堿水解法檢測(cè)肺組織中羥脯氨酸(hyp)的含量。結(jié)果 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺泡炎及纖維

2、化程度明顯高于陰性對(duì)照組；與模型組比較,涼血活血法組肺組織中hyp含量顯著降低(p0.01),balf中tgf-1含量顯著降低(p0.01)。結(jié)論 涼血活血法能明顯減輕博萊霉素所致的小鼠肺纖維化程度,降低肺組織中hyp含量。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制tgf-1蛋白表達(dá),減少膠原蛋白的產(chǎn)生,使肺纖維化病變減輕。 【關(guān)鍵詞】 肺纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1；羥脯氨酸；涼血活血法；小鼠 abstract：objectives to study the effect of cooling blood and invigorating circulation method on prevention and tr

3、eatment of pulmonary fibrosis, and explore its mechanism. methods male icr mice were randomly divided into 4 groups：negative control group, pulmonary fibrosis model group, cooling blood and invigorating circulation group and prednisone positive control group. the pulmonary fibrosis model of mice wer

4、e established by blm nasal instillation. after 8 hours, the mice were given prescription of cooling blood and invigorating circulation (xijiao dihuang decoction) by gastric perfusion. at the 28th day after treatment, the indexes were detected. the tgf-1 content of bronchoalveolar lavage fluid (balf)

5、 was tested by enzyme linked immunosorbent assay, and hydroxyproline (hyp) was examined by alkaline hydrolysis. results the degree of airsacculitis and fibrosis in model group are obviously higher than the negative control group by pathological observation. compared with model group, hyp content was

6、 decreased obviously in herb group (p0.05). compared with model group, tgf-1 content was increased obviously in herb group (p0.05). conclusions the method of cooling blood and invigorating circulation can reduce the degree of airsacculitis and fibrosis, and decrease the content of hyp and tgf-1 in l

7、ung tissue and balf. its possible mechanism may be relate to inhibiting tgf-1 expression and decreasing collagen protein production, which lead to the reduction of degree of airsacculitis and fibrosis. key words：pulmonary fibrosis；tgf-1；hydroxyproline；cooling blood and invigorating circulation metho

8、d；mice 2003年,傳染性非典型肺炎肆虐,在其病理演變過(guò)程中可出現(xiàn)不同程度的纖維化病理改變1。西醫(yī)以皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒藥物治療,但僅有10%30%肺纖維化患者經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療有一定的療效2,且激素不良反應(yīng)大,常出現(xiàn)大面積股骨頭壞死的情況,致殘率非常高。本實(shí)驗(yàn)研究涼血活血法對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用,不僅為肺纖維化提供中醫(yī)辨證論治新治法和有效方劑,而且從轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1(tgf-1)含量變化探討其作用機(jī)制。 1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 動(dòng)物 雄性清潔級(jí)icr小鼠28只,體重2528 g,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)：scxk (滬)2004-0005號(hào),飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房。

9、 1.2 藥物 強(qiáng)的松片,上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)(批號(hào)071201)；犀角地黃湯由水牛角、生地黃、赤芍、牡丹皮組成,飲片購(gòu)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,按常規(guī)方法煎制成每毫升藥液含1 g原藥材。 1.3 試劑 天狼星紅(sirius redf3b),購(gòu)自德國(guó)默克公司。小鼠tgf-1定量elisa試劑盒,上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；羥脯氨酸(hyp)試劑盒,南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)；博萊霉素粉劑,每支15 mg,日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)(批號(hào)270560)。 1.4 主要儀器 jj300型精密電子天平,常熟雙杰測(cè)試儀器廠制造；k-70全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī),湘儀-tomy聯(lián)合制

10、造；uv754n紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),上海光學(xué)儀器廠制造；specotrat酶標(biāo)比色儀,slt公司制造。 2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 造模和分組 將雄性icr小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、肺纖維化模型組、涼血活血法組、陽(yáng)性對(duì)照組,每組7只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后造模。陰性對(duì)照組經(jīng)鼻滴入生理鹽水20 l,其余各組經(jīng)鼻滴入博萊霉素7 g/g(20 l)建立肺纖維化模型。各組小鼠于28 d處死。 2.2 給藥 涼血活血法組用犀角地黃湯,陽(yáng)性對(duì)照藥用強(qiáng)的松片。造模8 h開始常規(guī)灌胃給藥,每日1次。各組給藥劑量按人與小鼠體表面積比進(jìn)行換算。涼血活血法組小鼠的等效劑量為每日15.86 g/kg；陽(yáng)性對(duì)照組給藥劑量根據(jù)臨床使

11、用情況及文獻(xiàn)用量定為1.3 mg/kg,藥液濃度為0.1 mg/ml,用生理鹽水作為溶劑；模型組和陰性對(duì)照組給予等體積的生理鹽水灌胃。 2.3 肺間質(zhì)纖維化小鼠肺組織病理學(xué)觀察 新鮮分離的小鼠右下葉肺組織,常規(guī)經(jīng)10%福爾馬林固定和石蠟包埋。每個(gè)蠟塊連續(xù)切片2張,1張做常規(guī)he染色,光鏡下觀察組織病理學(xué)變化；1張用0.1%苦味酸天狼星紅溶液做天狼星紅染色,光鏡下觀察肺間質(zhì)纖維化的有無(wú)及程度。 2.4 肺間質(zhì)纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定 取于-70 冰柜凍存的肺組織,按南京建成生物工程研究所hyp測(cè)試盒說(shuō)明書操作。hyp含量結(jié)果以g/g表示。 2.5 肺間質(zhì)纖維化小鼠支氣管肺泡灌洗液轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)

12、因子-1測(cè)定 各組小鼠處死后獲取支氣管肺泡灌洗液(balf),用elisa法檢測(cè)tgf-1的蛋白含量,操作均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用spss15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以xs表示,對(duì)各組數(shù)據(jù)行方差分析和組間比較(方差齊用lsd檢驗(yàn),不齊用games-howell檢驗(yàn)),po.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4 結(jié)果 4.1 涼血活血法對(duì)肺間質(zhì)纖維化小鼠肺組織病理的影響 陰性對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺被膜未見(jiàn)纖維素滲出及炎細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁完整,肺泡隔完整、無(wú)增寬,無(wú)肺萎陷及血管壁增厚,支氣管腔及肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)炎性滲出物,少數(shù)小鼠各級(jí)支氣管壁及肺泡間隔可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組造模

13、第28 日時(shí)肺組織可見(jiàn)實(shí)變,實(shí)變區(qū)呈斑片狀分布,在支氣管周圍病變尤為明顯。肺泡間隔增寬充血,可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。局部?型肺泡上皮細(xì)胞增生,肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)巨噬細(xì)胞簇集成團(tuán),局部可見(jiàn)陳舊性出血灶,纖維母細(xì)胞及纖維細(xì)胞增生,纖維化區(qū)可見(jiàn)大量增生的纖維細(xì)胞和膠原纖維沉積,炎性細(xì)胞相對(duì)較少,可見(jiàn)大小不等的囊性纖維氣腔形成即“蜂窩肺”。造模第28日已具備成纖維細(xì)胞灶、伴膠原沉積的瘢痕化、蜂窩等診斷普通型間質(zhì)性肺炎/特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(uip/ipf)的病變。涼血活血法組和陽(yáng)性對(duì)照組在用藥28 d后,病變程度與模型組相比有所減輕,而且涼血活血法組膠原沉積、成纖維細(xì)胞灶比陽(yáng)性對(duì)照組減少,炎性浸潤(rùn)也減輕。見(jiàn)圖1、

14、圖2。 4.2 涼血活血法對(duì)肺間質(zhì)纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸、肺泡灌洗液轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1含量的影響 (見(jiàn)表1) 表1 各組小鼠肺組織 hyp、balf中tgf-1含量比較(略)注：與陰性對(duì)照組比較,#p0.01；與模型組比較,p0.01 5 討論 肺間質(zhì)纖維化的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積,膠原蛋白合成的速度大于降解的速度,因此膠原纖維顯著增多,最終導(dǎo)致膠原的逐漸累積。hyp是膠原纖維中特有的一種氨基酸,約占膠原蛋白的13.4%,其他除彈性硬蛋白含少量hyp(約1%)外,均不含hyp。因此,hyp含量的測(cè)定成為間接反映膠原含量的敏感指標(biāo)而被廣泛應(yīng)用于肺間質(zhì)纖維化的研究3-4。本實(shí)驗(yàn)用涼血活血法防治肺

15、纖維化28 d后,hyp含量減少,說(shuō)明涼血活血法能明顯減輕博萊霉素所致的小鼠肺泡炎及纖維化程度。 tgf-1參與纖維增殖性病變,是間葉細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因素,是強(qiáng)效的致纖維化因子5。肺內(nèi)的tgf-1可由肺泡巨噬細(xì)胞、間質(zhì)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肺泡?型上皮細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等產(chǎn)生。在損傷的早期,tgf-1來(lái)源于血小板的顆粒,將信號(hào)傳導(dǎo)到間質(zhì)間葉細(xì)胞,使其分化成肌成纖維細(xì)胞。后期由于肺泡腔內(nèi)充滿了肌成纖維細(xì)胞,從巨噬細(xì)胞和間葉細(xì)胞來(lái)源的tgf-1使運(yùn)動(dòng)增殖性細(xì)胞向膠原合成轉(zhuǎn)化,這一過(guò)程將導(dǎo)致肺泡腔內(nèi)膠原沉積、氣腔收縮和肺泡塌陷。tgf-1對(duì)間葉細(xì)胞的增殖作用具有雙向性。在肺泡纖維化的增殖期, tgf

16、-1可通過(guò)誘導(dǎo)自分泌血小板轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(pdgf)而促進(jìn)纖維增生；隨著氣腔充滿,tgf-1可以直接通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2和4導(dǎo)致細(xì)胞周期停止。tgf-1能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生pdgf受體,從而使pdgf的作用放大6。tgf-1刺激細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)產(chǎn)生細(xì)胞,合成大量ecm；抑制ecm降解酶主要為基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)的活性；增強(qiáng)這些降解酶抑制物的活性,從而減少ecm的降解；刺激成纖維細(xì)胞中-平滑肌肌動(dòng)蛋白(-sma)基因表達(dá),改變成纖維細(xì)胞收縮表型,調(diào)節(jié)肺炎細(xì)胞和上皮細(xì)胞的功能轉(zhuǎn)變,發(fā)生表型轉(zhuǎn)變的成纖維細(xì)胞能合成和分泌大量膠原等ecm成分,而且tgf-1能增強(qiáng)ecm受體的表達(dá),促進(jìn)ecm與

17、細(xì)胞粘附?？梢?jiàn),tgf-1在肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的多個(gè)環(huán)節(jié)起作用。本實(shí)驗(yàn)研究顯示,用涼血活血法防治肺纖維化28 d后,tgf-1含量顯著下降,這說(shuō)明涼血活血法能明顯減輕博萊霉素所致的小鼠肺泡炎及纖維化程度,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制tgf-1蛋白的表達(dá),減少了膠原蛋白的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的。 【參考文獻(xiàn)】 1 劉敏雯,嚴(yán) 夏,鐘世杰,等.傳染性非典型肺炎所致肺纖維化的中醫(yī)辨治探討j.中國(guó)中醫(yī)急癥,2004,13(7)：411412.2 羅 玲,劉 忠.特發(fā)性肺纖維化的治療現(xiàn)狀j.臨床肺科雜志,2007, 12(9)：967969.3 sn iyer, g gurujeyalakshmi, sn giri.

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