雞痘病毒ORF214原核表達(dá)蛋白單克隆抗體的制備及其初步鑒定

1、1197論著文章編號:1007-8738(2007)12-1197-03雞痘病毒ORF214原核表達(dá)蛋白單克隆抗體的制備及其初步鑒定王彥紅,馬懷良,時紅星,吳培培,彭大新,劉秀梵3(揚(yáng)州大學(xué)畜禽傳染病學(xué)農(nóng)業(yè)部重點開放實驗室,江蘇揚(yáng)州225009)摘要目的:經(jīng)發(fā)表的雞痘病毒美國致病株(FPVUS)ORF214基因序列,利用PCR方法擴(kuò)增出目的片段,測序后1材料和方法、BL21(DE3)由本室保存;pET21.1材料宿主菌DH528a由本室保存;載體PCR211購自Invirtogen公司,282E4株FPV(疫苗株)購自中國獸藥監(jiān)察所。重組桿狀病毒reBac2ORF214(本室研制),Sp2/0

2、骨髓瘤細(xì)胞和sf9細(xì)胞由本實驗并克隆至原核表達(dá)載體pET228a,用表達(dá)產(chǎn)物制備抗FPVORF214蛋白單克隆抗體(mAb)。方法:以雞痘病毒ORF214原核表達(dá)蛋白作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合,用間接ELISA方法檢測篩選。結(jié)果:陽性細(xì)胞株經(jīng)3代克隆純化后,獲得3株能穩(wěn)定分泌抗FPVORF214蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2F10C9、3C3B10、2G8G7。3株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均能室保存。HisBindKits購自Novagen公司,FITC標(biāo)記的羊抗鼠(IgG+IgM)抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠(IgG+IgM)和DAB購自Sigma公

3、司。無特定病原體(SPF)雞胚購自山東家禽所SPF雞場,BALB/c雌性小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,Sf2900IISFM購自Gibco公司。1.2方法1.2.1PCR產(chǎn)物回收、根據(jù)FPVUS夠特異地與FPVORF214蛋白反應(yīng),細(xì)胞上清ELISA效價均24在110以上,mAb腹水效價達(dá)110以上。結(jié)論:該特異性mAb的研制成功為進(jìn)一步研究ORF214的生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞雞痘病毒;ORF214;單克隆抗體(mAb)中圖分類號R392.11文獻(xiàn)標(biāo)識碼B()的上下游設(shè)計1對引ind。PCR擴(kuò)增出,用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer1210(寶生物

4、工程大連有限公雞痘病毒(fowl、禽痘病毒屬的成員,其中FPV是禽痘病毒屬的代表種。12000年Afonso等公布了雞痘病毒美國致病株(FP2VUS)的全基因組序列,FPV的ORF214編碼蛋白是參與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因,Stephen等認(rèn)為ORF214編碼Mr為13700的蛋白,與痘苗病毒的IL218BP在氨基酸序列上有29%的相似性。痘病毒基因3,4編碼IL218BP的同源物,例如天花病毒(VV)、傳染性軟疣病毒(MCV)等都有相應(yīng)基因編碼IL218BP。而且,在97位是酪氨酸,104位是苯丙氨酸,這兩個位置是人IL218BP結(jié)合IL218的活性位點,在MCV的MC054L編碼蛋白也是保守的

5、。但是,由于禽IL218BP的基因結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)仍未被人所知,由于禽類與哺乳動物的差異性,因此,ORF214編碼蛋白的生物學(xué)功能需要進(jìn)一步鑒定。其研究ORF214編碼蛋白特異性單克隆抗體(mAb)的制備為研究該蛋白的生物學(xué)功能有重要意義,另一方面也可能作為檢測禽類內(nèi)源性同源物的試劑。收稿日期:2007-01-23;接受日期:2007-03-27基金項目:國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)資助項目(2001AA213041)作者簡介:王彥紅(1974-),女,安徽壽縣人,講師,博士生Tel:0514287979036;E2mail:yyf76072,對司)回收,回收產(chǎn)物與PCR2112TA載體連接

6、并轉(zhuǎn)化DH5重組質(zhì)粒用EcoRI酶切鑒定,篩選出陽性重組質(zhì)粒,然后由上海聯(lián)合基因科技(集團(tuán))有限公司對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。1.2.2ORF214表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)陽性重組質(zhì)粒PCR2112ORF214和pET228a用EcoRI酶切,將pET228a酶切產(chǎn)物去磷酸化,回收ORF214片段與pET228a載體片段連接并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)中,對重組質(zhì)粒用Hind酶切鑒定,由上海聯(lián)合基因科技(集團(tuán))有限公司對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,序列與方向完全正確,得到陽性表達(dá)質(zhì)粒pET2ORF214。將陽5性克隆細(xì)菌BL21(DE3)/pET2ORF214按常規(guī)方法用IPTG誘導(dǎo),收集菌體,以超聲波破碎后、離

7、心,將上清與沉淀分別制樣,并對樣本進(jìn)行SDS2PAGE電泳,鑒定pET2ORF214融合蛋白是否以可溶性蛋白存在還是以包涵體形式存在。1.2.3免疫原的制備陽性克隆細(xì)菌BL21(DE3)/pET2ORF214,用IPTG誘導(dǎo)后,對菌體沉淀物進(jìn)行SDS2PAGE電泳,取凝膠浸泡于預(yù)冷的0125mol/LKCl溶液中染色10min左右,切下目的條帶研磨,加入PBS稀釋,-20保存。1.2.4檢測抗原的制備根據(jù)HisBindKits方法純化ORF214表達(dá)蛋白。將陽性克隆細(xì)菌按常規(guī)方法5用IPTG誘導(dǎo),收獲菌液10000g離心10min,棄上清后加入1BindingBuffer,超聲波處理后5000

8、g離心15min。用含6mol/L的尿素的1BindingBuffer重懸沉淀,冰浴1h,16000g離心30min,取上清,用0145m濾膜過濾上清。將上清按照HisBindKits說明引流過柱,收集純化的表達(dá)蛋白。1.2.5mAb的制備按參考文獻(xiàn)6的方法進(jìn)行,免疫原免3Correspondingauthor,Tel:051427991416E2mail:xfliumail.Y11982.2ORF214基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定構(gòu)建pET2ORF214重組表達(dá)載體,pET2ORF214經(jīng)Hind酶切鑒定得到疫8周齡BALB/c雌性小鼠,取免疫鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,篩選方法采用間接EL

9、ISA。采用方陣滴定法7確定檢測抗原最佳包被濃度。用pH916的0105mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋提純的抗原包被酶標(biāo)板,設(shè)置陽性對照(免疫鼠血清)、陰性對照(正常鼠血清)和空白對照,酶聯(lián)免疫檢測儀測定A490值,P/N211并接近陽性對照的雜交瘤細(xì)胞為陽性。檢測為陽性的雜交瘤細(xì)胞按有限稀釋法進(jìn)行亞克隆3次,挑選反應(yīng)較強(qiáng)的單個克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)作為建株細(xì)胞。1.2.6mAb的特性鑒定(1)效價測定8約700bp和5400bp兩個片段(圖2),再次測序結(jié)果表明其序列及方向正確。用IPTG誘導(dǎo)后,表達(dá)蛋白以包涵體的形式存在,表達(dá)的蛋白Mr約為24000,與預(yù)期的蛋白大小一致。:采用間接ELISA分別測

10、定細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水中mAb的效價。(2)Ig亞類的鑒定:按照亞類鑒定試劑盒說明書進(jìn)行。1.2.7間接免疫熒光反應(yīng)(IFA)制備單層次代CEF,24h后接種011mol/L282E4株FPV,同時以2個MOI重組桿狀病毒reBac2ORF214接種sf9細(xì)胞,培養(yǎng)72h后,棄去培養(yǎng)基,用PBS(0101mol/L,pH714)洗滌1次,用冷甲醇固定10min,制備的mAb作為一抗,FITC標(biāo)記的羊抗鼠(IgG+IgM)抗體作為二抗,在熒光倒置顯微鏡下觀察,出現(xiàn)特異的亮綠色熒光者為陽性,反之判為陰性。用未感染病毒的次代CEF和sf9細(xì)胞作為陰性對照。1.2.8Westernblot檢測以5個MO

11、I重組桿狀病毒reBac2ORF214接種sf9細(xì)胞及未感染的sf9細(xì)胞,培養(yǎng)72h后,棄2.3mAb的制備間接ELISA篩選,共獲得3,分別命名為:2F10C9、。3上清ELISA效價均在。4mAb的特性鑒定(1)效價測定:雜交瘤2F10C9、3C3B10、2G8G7細(xì)胞培養(yǎng)上清的ELISA效價,分別為1256、1128和1128。(2)Ig亞類的鑒定:2F10C9、3C3B10、2G8G7圖2重組質(zhì)粒酶切鑒定M:200bpmarker;1:PCR2.12ORF214/EcoRI酶切;2:pET2ORF214/Hind酶切.去培養(yǎng)基,制備樣品。(DE3)/pET2ORF214印法將蛋白轉(zhuǎn)移到

12、NCmL/L小牛血清的PBS過夜封閉,0101mol/L,pH714PBS洗滌3次,每次5min,制備的mAb作為第一抗體,37作用1h,洗滌3次,的Ig亞類,分別為IgG1、IgM和IgM。2.5IFA檢測IFA結(jié)果顯示未感染病毒的CEF無特異性同上,酶標(biāo)羊抗鼠抗體37作用1h,洗滌3次,同上,顯色5min,以水洗滌中止反應(yīng)。熒光,而接種282E4株FPV的細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光,但熒光亮度較弱。未感染病毒的sf9細(xì)胞無特異性熒光(圖3),重組桿狀病毒reBac2ORF214接種sf9細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光。2結(jié)果2.1FPVORF214基因的基因克隆及序列測定以282E4株FPV基因組為模板,分別

13、擴(kuò)增ORF214基因,用10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,可見大小約700bp片段(圖1),與預(yù)期的片段大小一致。重組質(zhì)粒用EcoRI酶切鑒定,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物已克隆到PCR2112TA載體。通過測序,證實擴(kuò)增到ORF214基因,所得序列與GenBank上的AF198100和AJ581527比較發(fā)現(xiàn):282E4株FPV病毒株的ORF214基因與雞痘病毒美國致病株(FPVUS)和英國弱毒株(FP9)完全一致。圖3間接免疫熒光反應(yīng)顯微鏡觀察A:未感染重組桿狀病毒reBac2ORF214的sf9細(xì)胞;B:感染重組桿狀病毒reBac2ORF214的sf9細(xì)胞.2.6Westernblot分析感染重組桿狀病毒

14、的sf9細(xì)胞的泳道上顯現(xiàn)出約Mr大小約為60000的棕紅色條帶(真核表達(dá)產(chǎn)物具有糖基化結(jié)構(gòu),數(shù)據(jù)未發(fā)表),條帶顯色較弱;重組陽性圖1PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析M:200bpmarker;1:ORF214PCR產(chǎn)物.菌的泳道上出現(xiàn)Mr大小約為24000棕紅色條帶,條帶顯色明顯。未感染的sf9細(xì)胞未出現(xiàn)條帶。11993討論參考文獻(xiàn):9痘病毒具有許多參與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因,雖然近十幾年來,FPV載體疫苗的研究取得了巨大的進(jìn)展,然而其自身的基因功能研究卻很少。自1Afonso等公布了雞痘病毒美國致病株(FPVUS)的全基因組序列,并對基因組進(jìn)行了較為全面的分析,從而為研究雞痘病毒的分子生物學(xué)特性的

15、研究提供了有利工具鑒定了基礎(chǔ)。本實驗中利用pET228a原核表達(dá)體系成功表達(dá)雞痘病毒ORF214編碼蛋白,重組蛋白以包涵體的形式存在,經(jīng)SDS2PAGE電泳,切膠作為免疫原,利用純化的抗原作為檢測原,成功地篩選出3株能穩(wěn)定分泌mAb的雜交瘤細(xì)胞。ORF214編碼蛋白特異性mAb的制備為研究該蛋白的生物學(xué)特性具有重要意義,另一方面也可作為檢測禽類內(nèi)源性同源物的試劑。間接免疫熒光法檢測mAb與雞痘病毒正常分泌蛋白及重組桿狀病毒reBac2ORF214表達(dá)產(chǎn)物均有特異性反應(yīng),而且真核表達(dá)產(chǎn)物的量明顯高。Westernblot結(jié)果表明mAb與重組桿狀病毒表達(dá)的蛋白能特異性反應(yīng)。此mAb的制備為研究該蛋

16、白提供了新試劑,性創(chuàng)造了條件。1AfonsoCL,TulmanER,LuZ,etal.ThegenomeoffowlpoxvirusJ.JVirol,2004,74(8):3815-3831.2LaidlawSM,SkinnerMA.ComprisonofthegenomesepuenceofFP9,anattenuated,tissueculture2adaptedeuropeanstrainoffowlpoxvirus,withthoseofvirulentamericanandeuropeanvirusesJ.JGenVirol,2004,85(2):305-322.3SmithVP,A

17、lcamA.InhibitionofinterferonsbyectromeliavirusJ.JVirol,2002,76(3):1124-1134.4BornTL,MorrisonLA,EstebanDJ,etal.ApoxvirusproteinthatbindstoandinactivatesIL218,andinhibitsNKcellresponseJ.JImmunol,2000,164(6):3246-3254.5薩姆布魯克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T(金冬雁,等譯).分子克隆實驗指南M.第2版.北京:科學(xué)出版社,1999:830-831.6劉秀梵.單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用M.合

18、肥:安徽科技出版社,1994:168-174.7徐宜為.免疫檢測技術(shù)M.第2版.北京:科學(xué)出版社,1997:167-182.8楊健美,高崧,林矯矯,等.抗志賀樣毒素型變異體單克隆抗體的制備及特性鑒定J.,2006,226):807808.,pMM.imorsencodedbypox2J.Microbiology,2000,3(4):371-(上接1196頁)少致免疫抑制。我們的結(jié)果顯示,患者急性期大都伴有不同種類的白細(xì)胞受感染,淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞之間無統(tǒng)計學(xué)意義。病情恢復(fù)14個月后復(fù)查血白細(xì)胞EA抗原,無1例白細(xì)胞EA陽性,表明EA是HCMV病毒血癥的指標(biāo)。參考文獻(xiàn):1嚴(yán)華,戴斌.

19、HCMV2mAb的研制檢定和應(yīng)用J.單克隆抗陽性,可能與我們用單特異性(p72)mAb有關(guān),故用多特異性(如p72和p65)mAb,可提高EA檢測技術(shù)敏感性。EA陽性而CPE陰性可能與抗病毒治療有關(guān),故2種技術(shù)同時檢測有助于判定抗病毒療效。就標(biāo)本的種類而言,BAL、尿液比血標(biāo)本更適合用EA檢測技術(shù)?？紤]到所有種類的樣本,2種技術(shù)在檢測HCMV方面無明顯差異。但EA檢測技術(shù)出結(jié)果僅需1h,而傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)需要23周。5例EA陽性而IgM陰性可能是免疫抑制所致,因為標(biāo)本取自免疫抑制患者。表明EA(IHC)檢測更適合免疫抑制患者HCMV感染的診斷。我們比較了2種Mr500000和79000的葡聚糖,二者在白細(xì)胞的得率與純度上無明顯差異。葡聚糖攜帶紅細(xì)胞沉降法能有效分離白細(xì)胞,方法簡便、快捷而穩(wěn)定。但其分離效果受葡聚糖的Mr和純度的影響,白細(xì)胞分離時選用高M(jìn)r的葡聚糖更為理想,更節(jié)省時間。用40g/L中性多聚甲醛固定后的細(xì)胞片,在-20以下保存半年,p72抗原性仍穩(wěn)定。關(guān)于白細(xì)胞內(nèi)HCMV感染研究,國外報道結(jié)果不一,有些作者認(rèn)為以中性粒細(xì)胞感染為主,單個核細(xì)胞特別是淋巴細(xì)胞感染極少,亦有人認(rèn)為單核細(xì)胞感染較多,從而使IL21產(chǎn)生減體通訊,1994,10(3):27-30.2KerosLG,CointeD.Diagnosisandprognost