鉻對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4 基因表達(dá)的影響_圖文

1、196鉻對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4基因表達(dá)的影響孫 忠，吳蘊(yùn)棠，車素萍，王 夏1，郭 剛（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，天津300070；1中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100080）【摘 要】目的：探討補(bǔ)鉻對(duì)糖尿病大鼠糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法：對(duì)前期研究分離到的與補(bǔ)鉻200 µg /（kg bw d）有關(guān)的糖尿病大鼠差異顯示的基因片段進(jìn)行克隆、測序及同源性分析，根據(jù)待檢測的基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，進(jìn)行RT-PCR 檢測。以激光密度掃描儀進(jìn)行光密度掃描分析，以目的基因與參考基因的灰度比值反映其表達(dá)水平。結(jié)果：差顯片段Cr-3的堿基序列與GLUT4同源性為98%。各組大鼠骨骼肌組織中

2、GLUT4 mRNA 的表達(dá)：糖尿病補(bǔ)鉻組GLUT4表達(dá)量低于正常對(duì)照組(P <0.05，高于糖尿病對(duì)照組(P <0.05。結(jié)論： 給糖尿病大鼠補(bǔ)充微量元素鉻可以上調(diào)骨骼肌組織中GLUT4 mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而使骨骼肌組織中GLUT4含量增加，這可能是鉻改善糖尿病大鼠糖、脂代謝紊亂的分子機(jī)制之一。關(guān)鍵詞： 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4(GLUT4；糖尿病大鼠；RT-PCR；基因克??；鉻 中圖分類號(hào)：R151.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0512-7955(200503-0196-04STUDY ON REGULATION OF CHROMIUM ON GLUT4 EXPRESSION OF

3、 SKELETALMUSCLE IN DIABETIC RATSSUNZhong ，WU Yun-tang，CHE Su-ping，WANG Xia，GUO Gang ( School of Public Health, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China【Abstract 】Objective: To study the regulation of chromium on the related gene expression of glucose metabolism in skeletal muscle in diabeti

4、c rats. Methods : cDNA fragments were cloned, sequenced from our former research and its homology analysis has been done. RT-PCR was performed using the primers designd according to the sequence of cDNA. Results : The sequence identities between Cr-3 and GLUT4 were 98%. The GLUT4 mRNA expression lev

5、el of DM+Cr group was obviously lower than that of normal group (P <0.05, and higher than that of DM group (P <0.05. Conclusion: Chromium supplementation can increase the expression level of GLUT4 mRNA and the content of GLUT4 in skeletal muscle in diabetic rats. It may be one of the mechanism

6、s that chromium can partially improve the disorders of glucose and lipid metabolism in diabetic rats.Key words： GLUT4；diabetic rat；RT-PCR ； gene clone ；chromium微量元素鉻作為葡萄糖耐量因子的重要組成部分，對(duì)于改善受試者的胰島功能及糖耐量具有一定的作用1，但對(duì)糖尿病相關(guān)基因的表達(dá)影響，國內(nèi)報(bào)道較少。我們?cè)谇捌谘芯恐袑?duì)糖尿病大鼠收稿日期：2004-08-20基金項(xiàng)目：天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金(No.01-20804；天津市自然科學(xué)基金(N

7、o.9903606611 作者簡介：孫忠(1964-，男，碩士，副教授營養(yǎng)學(xué)報(bào)2005年第27卷第3期 197每日以200 µg/kg bw的劑量灌胃補(bǔ)鉻60 d后，提取大鼠骨骼肌組織總RNA，以mRNA 差異顯示技術(shù)分離到400 bp 以上的cDNA 片段11條。本研究擬對(duì)這些cDNA 片段進(jìn)行克隆、測序、同源性分析等，以期發(fā)現(xiàn)鉻調(diào)控糖尿病代謝紊亂的相關(guān)基因及其功能，為闡明作用的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。1 材 料 與 方 法1.1 差異顯示cDNA 片段與菌株cDNA片段來自前期研究的糖尿病補(bǔ)鉻組與糖尿病對(duì)照組差異顯示的cDNA 片段11條 2； E.coli DH5為中國科學(xué)院微生

8、物研究所新技術(shù)室保存；pGEM-T easy vector（Promega）。 1.2 主要化學(xué)試劑及儀器設(shè)備T 4DNA 連接酶（TaKaRa）、限制性內(nèi)切酶Eco R 及Sac （Promega ）、質(zhì)粒提取試劑盒（Promega）、Taq DNA 聚合酶（Gibco）、dNTP（Beckman）、X-gal （Promega）、IPTG （Promega）、Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶（Gibco）、DNA熱循環(huán)儀 (Perkin Elmer Cetus 公司 、紫外透射儀 (Cole-Parmer公司、UV-2510PC 型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司。1.3 方法 1.3.1 差異

9、顯示基因片段的再擴(kuò)增：擴(kuò)增引物為：M13 reverse 24-mer primer：5,AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3,； T7 Promoter 22-mer primer：5,GTAATACGA- CTCACTATAGGGC 3, 。PCR反應(yīng)條件：952min9215s，5030s，72 2 min，4個(gè)循環(huán)9215s，6030s，722min，25個(gè)循環(huán)727min4貯存。選擇400bp 以上的片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收目的條帶。 1.3.2 PCR 產(chǎn)物的克隆、測序及同源性分析：PCR產(chǎn)物的克隆按照說明書進(jìn)行，酶切產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定大

10、小。鑒定酶切片段與插入片段等大小后進(jìn)行測序，用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI的Blastn 作為主要的檢索工具，進(jìn)行序列的同源性分析。 1.3.3 RT-PCR 鑒定：正常對(duì)照組(NC、糖尿病對(duì)照組(DM和糖尿病補(bǔ)鉻組(DM+Cr大鼠，每組大鼠只，共24個(gè)骨骼肌標(biāo)本，采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取總RNA，并經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢查其完整性。根據(jù)測序及同源性分析結(jié)果，對(duì)已知基因設(shè)計(jì)特異性引物（表），用于從各組RNA擴(kuò)增已知差異基因，以驗(yàn)證該差異片段是否為假陽性。包括用于差異顯示的3個(gè)RNA樣品在內(nèi)共27個(gè)RNA樣品參加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 5 min94 30s，60

11、 30s，72 45s，25個(gè)循環(huán) 72 7min4 貯存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用激光密度掃描儀進(jìn)行光密度掃描分析。Table 1 Base sequences of -actin and GLUT4GeneProduct length Primers-actinForward 611 GTCGTACCACTGGCATTGTGReverseCAGTGAGGCCAGGATAGAGC GLUT4Forward Reverse482ACATCAGGTGGTGGGAAGAG CACAGATGGAGCCATAGCA1.4 統(tǒng)計(jì)分析各組間表達(dá)水平用SPSS 11.5 for Windows

12、進(jìn)行單因素方差分析。2 結(jié) 果2.1 差異顯示基因片段的再擴(kuò)增經(jīng)mRNA 差異顯示技術(shù)分離到DM+Cr組與DM 組之間出現(xiàn)明顯差異的400 bp以上的cDNA 片段11條，分別以Cr-1Cr-11表示。其中Cr-3在NC 組、DM+Cr組中高表達(dá)，DM 組中低表達(dá)。用T7引物和Reverse M13引物對(duì)回收的片段進(jìn)行再擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為單一片斷，無雜片段污染。 2.2 差異顯示基因片段Cr-3的克隆及酶切鑒定 上述Cr-3目的基因經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取后，用Sac和EcoR進(jìn)行兩次酶切后，結(jié)果與預(yù)期相同，在預(yù)計(jì)位置上出現(xiàn)了特異條帶（圖1）。Marker:

13、 Lambda DNA/Eco130I DNA Marker; 1,3,5: products of Sac; 2,4,6: products of EcoRFig. 1 Enzyme restriction electrophoresis of thecloned Cr-3 plasmid198 2.3 差異顯示基因片段的測序及分析結(jié)果將Cr-3基因的序列經(jīng)BLAST n軟件進(jìn)行檢索，結(jié)果顯示Cr-3與GLUT4(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4 的同源性為98%；測序全長為662；BLAST ID：1070559361-18835-4011920018 BLASTQ3；高同源性基因編號(hào)：gi|53686|

14、gb|36125.1|RATMEFGLUT；glucose transporter (GLUT4 Rattus norvegi- cus 全長：4542 bp。2.4 各組大鼠骨骼肌組織GLUT4基因的表達(dá) 以-actin做為內(nèi)參照物，擴(kuò)增GLUT4基因，其擴(kuò)增產(chǎn)物為482 bp，-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物為611bp，見圖26，表2。Table 2 mRNA expression of the validated differential genes in various groupsa:compare to NC group, P <0.05; b: compare to DM grou

15、p, P <0.05Fig. 2 GLUT4 mRNA expression in skeletalmuscle tissuesMarker: DL2000 marker; 1:NC；2:DM；3:DM+CrFig. 3 Validation of GLUT4 mRNA expression ofDD-PCR圖2,3顯示了3個(gè)骨骼肌組織中GLUT4 mRNA 的表達(dá)：GLUT4與-actin輝度比值，DM組較正常對(duì)照組明顯降低，DM+Cr組較DM 組有一定提高。Marker: DL2000 marker; 18:NC groupFig. 4 GLUT4 mRNA expression i

16、n NC groupMarker: DL2000 marker; 18: DM groupFig. 5 GLUT4 mRNA expression in DM groupMarker: DL2000 marker; 18:DM+Cr groupFig. 6 GLUT4 mRNA expression in DM+Cr group表2,圖46顯示了各組大鼠骨骼肌組織中GLUT4 mRNA 的表達(dá)水平：DM組、DM+ Cr 組GLUT4表達(dá)量均低于正常對(duì)照組(P 0.05，DM+Cr組則高于DM 組(P 0.05，但尚未恢復(fù)到正常水平。3 討 論葡萄糖分子進(jìn)入細(xì)胞需要細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（gluc

17、ose transporter,GLUT）的直接參與，這是組織利用葡萄糖的主要限速步驟。胰島素刺激外周組織攝取葡萄糖主要是通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體異構(gòu)體之一GLUT 4的作用實(shí)現(xiàn)3。胰島素可使型DM 大鼠GLUT4 mRNA及GLUT4水平增加4。與GLUT4/-actin 0.975±0.076 DM 0.776±0.067a DM+Cr0.894±0.064ab營養(yǎng)學(xué)報(bào)2005年第27卷第3期 199非DM 大鼠相比，自發(fā)的型DM 肥胖大鼠骨骼肌細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜上GLUT4含量分別減少50%和40%5；型DM 患者脂肪組織中GLUT4減少85%，GLUT4 mRNA

18、分別少于NC 和相同體重的非DM 患者86%和78%6，提示型DM 時(shí)外周組織所表現(xiàn)的胰島素抵抗與G L U T 4的變化有一定關(guān)系。 本研究結(jié)果提示，DM組大鼠骨骼肌中GLUT4表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯降低，可能是DM 動(dòng)物模型外周組織產(chǎn)生胰島素抵抗的原因之一。RT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果還顯示，DM+Cr組大鼠骨骼肌中GLUT4 mRNA 的表達(dá)水平雖然未達(dá)到正常水平，但較DM 組有所提高(P 0.05，提示給四氧嘧啶DM 大鼠補(bǔ)充鉻可上調(diào)骨骼肌組織中GLUT4 mRNA 的表達(dá)，而使骨骼肌組織中GLUT4含量增加，這可能是鉻改善DM 大鼠糖、脂代謝紊亂的分子機(jī)制之一。但補(bǔ)鉻對(duì)骨骼肌組織中GLU

19、T4從胞內(nèi)到脂膜的易位是否有促進(jìn)作用，有待進(jìn)一步研究。參 考 文 獻(xiàn)1 Mertz W. Chromium in human nutrition:a reviewJ. J Nutr, 1993,123: 626633.2 吳蘊(yùn)棠，孫忠，車素萍，等. 鉻對(duì)DM 大鼠糖、脂代謝及骨骼肌組織基因表達(dá)的影響J. 營養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2003,25: 256259.3 Tremblay F , Dubois MJ , Marette A. Regulationof GLUT4 traffic and function by insulin and contraction in skeletal muscleJ.

20、 FrontBiosci ,2003,8：10721084.4 Hoenack C, Roesen P. Inhibition of angiotensintype 1 receptor prevents decline of glucose transporter (GLUT4 in diabetic rat heart. J.Diabetes , 1996，45(suppl 1: S82S87.5 Marette A, AtGie C, Liu Z, et al. Differentialregulation of GLUT1 and GLUT4 glucose transpor- ter

21、s in skeletal muscle of a new model of type II diabetesJ. Diabetes , 1993,42: 11951201. 6 Garvey WT, Maianu L, Huecksteadt TP，et al.Pretranslational suppression of a glucosetransporter protein causes insulin resistance in adipocytes from patients with non-insulin- dependent diabetes mellitus and obe

22、sityJ. JClin Invest, 1991,87:10721081.* * * * *（上接195頁）7 杜衛(wèi)，張秀珍，梁惠. 尿中O 6-甲基鳥嘌呤與惡性腫 瘤關(guān)系的研究J. 腫瘤防治雜志，2003, 10：127 128.8 于守洋，劉志誠. 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)方法指 南M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1988. 129175. 9 石雁川，楊富清，陳炳卿，等. 抗壞血酸硬脂酸酯的維生素C 生物效應(yīng)研究J. 營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1996，18： 364366.10 Kovacikova Z，Ginter E，Madaric A. The effect of graded ascorbic acid intake on the activit