HBV相關(guān)性HCC患者癌組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)組差異分析

1、HBV相關(guān)性HCC患者癌組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)組差異分析                作者：林英姿，陳仁，楊文,李翠 【摘要】  目的: 應(yīng)用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析HBV相關(guān)性HCC癌組織與非癌肝組織蛋白質(zhì)組之間的差異，鑒定肝組織蛋白質(zhì)組中與HBV相關(guān)性HCC癌變相關(guān)的蛋白. 方法: 收集HBV相關(guān)性HCC患者手術(shù)切除的癌組織和癌周組織標(biāo)本，固相pH梯度2DE，凝膠銀染、掃描圖像、ImageMaster 2DE Elite4.01軟件分析差

2、異表達(dá)的蛋白質(zhì)；應(yīng)用質(zhì)譜儀得到相應(yīng)的肽質(zhì)指紋圖譜(PMF)，聯(lián)網(wǎng)到ExPASY服務(wù)器查詢相關(guān)數(shù)據(jù)庫鑒定獲得的差異蛋白質(zhì)點(diǎn). 結(jié)果: 癌組織、肝硬化組織和慢性肝炎組織平均每張蛋白斑點(diǎn)數(shù)為(1281±51), (1188±41)和(1235±31)個(gè)，重復(fù)性分析發(fā)現(xiàn)在等電聚焦（IEF）方向上平均偏差為（2.47±0.25）mm，在垂直板SDSPAGE電泳方向上的平均位置偏差為（2.86±0.31）mm. 47個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜分析獲得28張PMF，初步鑒定了其中的17張PMF. 結(jié)論：HBV相關(guān)性HCC的癌組織、肝硬化組織、慢性肝炎組織蛋白質(zhì)組之

3、間存在較明顯的差異，鑒定出的差異蛋白質(zhì)可能有助于研究HBV相關(guān)性HCC. 【關(guān)鍵詞】  乙型肝炎病毒；肝細(xì)胞癌；肝組織；蛋白質(zhì)組；雙向電泳；質(zhì)譜Differential proteomic analysis of hepatic tissues in HBV related hepatocellular carcinoma patients   【Abstract】 AIM: To explore differential proteome between cancerous tissue and pericancerous tissue in hepatitis

4、 B virus (HBV) infection related hepatocellular carcinoma (HCC) using twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE) and matrix associated laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS) and to identify the proteins related to liver carcinogenesis. METHODS: Hepatic t

5、issue specimens were obtained from 18 patients with HCC undergoing partial hepatectomy. Total proteins were separated by immobilized pH gradient (IPG)based 2DE. After silver staining, the gel images were acquired by image scanner and then analyzed with ImageMaster 2DE Elite4.01 software. Peptide mas

6、s fingerprint (PMF) of differential protein spots was obtained with MALDTOTMS. Then, the PMF were searched in SWISSPROT/TrEMBL database with the PeptIdent soft. RESULTS: According to 2DE maps, the average numbers of protein spots were (1281±51), (1188±41) and (1235±31) in cancerous, c

7、irrhotic tissues and chronic hepatitis tissues. The average position deviation of matched spots was (2.47±0.25) mm in IEF direction and (2.86±0.31) mm in SDSPAGE direction. Fortyseven differential protein spots were incised from 2DE gels and 28 PMF maps were obtained by MALDITOFMS. The PMF

8、 maps were searched in the SWISSPROT/TrEMBL database by PeptIdent software, and 17 proteins were preliminarily identified. CONCLUSION: There are significant proteome differences among chronic hepatitis，cirrhotic and cancerous tissuesThe proteins identified in this study may be useful in studies on H

9、BV infection related HCC.   【Keywords】 HBV; hepatocellular carcinoma; hepatic tissue; proteome; 2dimensional polyacrylamide gel electrophoresis; mass spectrometry0引言   肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，臨床流行病學(xué)及其他相關(guān)研究表明，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是HCC的主要致病因素，約有1

10、025%的慢性HBV感染患者最終發(fā)展為HCC1. 癌變組織細(xì)胞蛋白質(zhì)組與非癌變組織細(xì)胞蛋白質(zhì)組差異表達(dá)的研究是尋找癌變相關(guān)蛋白質(zhì)、發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記的有效途徑2. 我們應(yīng)用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，分析HBV相關(guān)性HCC癌組織與非癌肝組織蛋白質(zhì)組之間的差異，鑒定肝組織蛋白質(zhì)組中與HBV相關(guān)性HCC癌變有關(guān)的蛋白質(zhì).   1材料和方法   1.1材料人肝癌組織（避開中心壞死區(qū)）及癌周2 cm組織18例取自海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、海南省人民醫(yī)院20042005年間手術(shù)切除標(biāo)本，癌組織符合中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會2001-廣州會議原發(fā)性肝癌臨床分期期標(biāo)準(zhǔn)1-2；肝硬化標(biāo)

11、本12例和慢性肝炎組織6例經(jīng)病理檢查證實(shí). 癌患者年齡2572（平均46）歲，男20例，女4例，無酗酒病史，經(jīng)血清免疫學(xué)標(biāo)記物和分子生物學(xué)標(biāo)記證實(shí)為HBV感染，并經(jīng)血清抗HCV和HCVRNA檢測排除HCV感染. 取得組織后立予4生理鹽水反復(fù)沖洗3次以去除血液，置-80冰箱中保存待檢.   1.2方法將已處理過的標(biāo)本從-80冰箱中取出，稱取癌組織、非癌組織各100 mg置于研磨管，加入組織裂解液1.0 mL，于0冰水浴中機(jī)械碎裂成勻漿. 常溫靜置1 h后，再37孵育1 h，加痕量DNA酶和RNA酶A去除核酸. 懸液取出后在充分混溶，15 000 r/min，4離心1 h. 吸

12、取上清液即為肝組織的總蛋白質(zhì)，用Bradford法測定蛋白質(zhì)的濃度. 第一向固相pH梯度等電聚焦. 肝組織總蛋白600 mg與水化液、痕量溴酚藍(lán)混合為350 mL上樣液，加入IPGstrip持膠槽中，置入18 cm IPG線性干膠條(pH310L)，在20進(jìn)行等電聚焦，參數(shù)設(shè)置為：30 V，480 Vh；500 V，500 Vh；1000 V，1000 Vh；3500 V，7000 Vh和8000 V，56 000 Vh. 等電聚焦結(jié)束后在平衡液中平衡30 min，在20進(jìn)行第二向SDSPAGE電泳. 用硝酸銀溶液銀染使凝膠中的蛋白質(zhì)點(diǎn)可視化. LabScan掃描凝膠成像，ImageMaste

13、r 2D軟件對癌組織、肝硬化和慢性肝炎組織凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)的差異分析. 當(dāng)某一蛋白質(zhì)點(diǎn)在某一類型組織凝膠中表達(dá)較其他類型組織凝膠明顯增強(qiáng)(校正后蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量相差3倍以上)，并在不少于50的該類組織凝膠圖譜中表達(dá)，視其為差異蛋白質(zhì)點(diǎn). 切取凝膠內(nèi)的目標(biāo)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，以鐵氰化鉀脫色，DTT還原和碘乙酰胺烷基化，TPCK胰蛋白酶酶解，酶解后的肽用三氟乙酸和乙腈溶液萃取兩次. 以ZipTipTMC18吸頭對樣品進(jìn)行脫鹽，制備好的樣品用ProFlexTM MaldiTof質(zhì)譜儀進(jìn)行分析：線性模式，正離子譜測定，離子源加速電壓1為20 kV，加速電壓2為18.85 kV，N2激光波長337 nm，脈沖

14、寬度為3 ns，離子延遲抽取時(shí)間為500 ns，飛行管道真空度為4×10-7Torr，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次. 以基質(zhì)峰和胰蛋白酶自動降解離子峰作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正，對肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行校正. 聯(lián)網(wǎng)ExPaSy 網(wǎng)站，應(yīng)用PeptIdent軟件在SwissProt/TrEMBL database中查詢.   2結(jié)果   2.1癌組織與癌旁組織的2DE圖譜任意選取20個(gè)在癌組織、肝硬化肝組織和慢性肝炎肝組織凝膠圖譜中相互匹配、分辨清楚的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行位置重復(fù)性分析，發(fā)現(xiàn)在等電聚焦（IEF）方向上其平均偏差為（2.47±0.25）mm，在垂

15、直板SDSPAGE電泳方向上的平均位置偏差為（2.86±0.31）mm，表明蛋白質(zhì)點(diǎn)在位置上具有較好的重復(fù)性，此條件基本能滿足癌組織與非癌組織之間的蛋白質(zhì)組差異分析. 在相同的實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)設(shè)置條件下，測得癌組織圖譜平均每張蛋白斑點(diǎn)數(shù)為（1281±51）個(gè)，肝硬化組織圖譜平均蛋白斑點(diǎn)數(shù)為（1188±41）個(gè)，慢性肝炎組織組織圖譜平均蛋白斑點(diǎn)數(shù)為（1235±31）個(gè). 比較癌組織和癌周組織（肝硬化組織+慢性肝炎組織），在癌組織凝膠中發(fā)現(xiàn)14個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，在癌周組織凝膠中發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)12個(gè). 其中，肝硬化組織與癌組織比較，在癌組織凝膠中發(fā)現(xiàn)19個(gè)差異蛋

16、白質(zhì)點(diǎn)，在肝硬化組織凝膠中發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)16個(gè)；慢性肝炎肝組織和癌組織相比，在癌組織凝膠中發(fā)現(xiàn)21個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，在慢性肝炎組織凝膠中發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)17個(gè)（圖1，2）.   2.2癌組織與癌旁組織的2DE圖譜差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜選取上述47個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得28張PMF，應(yīng)用PeptIdent軟件搜索SWISSPROTTREMBL數(shù)據(jù)庫，初步鑒定了其中的17張PMF： 比較癌組織和癌周組織：癌組織凝膠圖譜中表達(dá)增加的14個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中（點(diǎn)號0114），得到11張PMF，有8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定（表1），1個(gè)點(diǎn)需進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，2個(gè)點(diǎn)沒有匹配數(shù)據(jù)庫

17、中的任何記錄. 癌周組織凝膠圖譜中表達(dá)增加的12個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中（點(diǎn)號AL），得到8張PMF，有5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定（表1），2個(gè)點(diǎn)需進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，1個(gè)點(diǎn)沒有匹配數(shù)據(jù)庫中的任何記錄. 比較癌組織和慢性肝炎組織：癌組織凝膠圖譜中表達(dá)增強(qiáng)的21個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)（點(diǎn)號0114, 2026）中，0114號差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定情況見表1，在2026號7個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中，得到3張PMF，有2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定（表1中的點(diǎn)22和點(diǎn)24），1個(gè)點(diǎn)沒有匹配數(shù)據(jù)庫中的任何記錄；慢性肝炎肝組織凝膠圖譜中表達(dá)增強(qiáng)的17個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（點(diǎn)號AL，QU）中，AL號點(diǎn)鑒定情況見表2，QU號5個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中，得到2張PMF，

18、只有1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定（表1中的U號點(diǎn)），另1個(gè)點(diǎn)需進(jìn)一步鑒定. 比較癌組織和肝硬化肝組織：在癌組織凝膠圖譜中表達(dá)增強(qiáng)的19個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)（點(diǎn)號0114，1519）中，0114號差異蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定情況見表1，在1519號5個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中，得到2張PMF，1個(gè)點(diǎn)需進(jìn)一步分析鑒定，另1個(gè)點(diǎn)的PMF沒有匹配數(shù)據(jù)庫中的任何記錄；肝硬化肝組織凝膠圖譜中表達(dá)增強(qiáng)的16個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（點(diǎn)號AL，MP）中，AL號點(diǎn)鑒定情況見表2，MP號4個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中，得到2張PMF，只有1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定（表1-25中的O號點(diǎn)），有1個(gè)點(diǎn)的PMF沒有匹配數(shù)據(jù)庫中的任何記錄.   

19、0;        3討論   慢性HBV感染是HCC最主要的致病因素，迄今，HCC其癌變機(jī)制仍不明確，現(xiàn)傾向于認(rèn)為HBV主要通過引起宿主肝臟慢性壞死性炎癥而間接導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變3. 蛋白質(zhì)組是指在特定的時(shí)間和空間上，一個(gè)細(xì)胞或組織基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)蛋白質(zhì)，包括各種亞型及蛋白質(zhì)修飾4. 癌變細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異在很大程度上是由功能基因及其所合成的蛋白質(zhì)的不同來決定的. 我們對可溶性肝組織總蛋白進(jìn)行了雙向凝膠電泳，部分蛋白質(zhì)在2DE凝膠上得到了高分辨率和重復(fù)性的展現(xiàn)，故癌組織、肝硬化組織、慢性肝炎組織凝膠圖譜之間存

20、在較好的可比性. 進(jìn)一步應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對所獲得的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了差異分析，結(jié)果表明慢性肝炎患者肝細(xì)胞癌變和肝硬化患者肝細(xì)胞癌變機(jī)制既有共同之處，但也存在一定差異. 共有差異蛋白質(zhì)點(diǎn)可能為探詢HCC特異性腫瘤標(biāo)記提供了線索.表1肝癌和矮周組織凝膠中鑒定的表達(dá)增強(qiáng)差異點(diǎn)蛋白質(zhì)activating protein 41來自數(shù)據(jù)庫的理論分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；2既往文獻(xiàn)中未曾報(bào)道其與HCC癌變相關(guān). aP0.05,癌組織凝膠中表達(dá)增強(qiáng)差異點(diǎn)蛋白質(zhì)vs慢性肝炎組織；cP0.05,肝硬化組織中在肝硬化組織凝膠中表達(dá)增強(qiáng)差異點(diǎn)蛋白質(zhì)vs癌組織.   對2DE凝膠上47個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行原位酶解

21、后，質(zhì)譜儀定獲得了28個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的PMF，應(yīng)用PeptIdent軟件搜索SwissProt/TrEMBL數(shù)據(jù)庫初步鑒定了其中的17個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn). 理論上講，所有輸入片段都應(yīng)與候選蛋白的片段相匹配，但仍有10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的部分片段與候選蛋白的理論降解片段不一致. 對于應(yīng)用PMF方法未能鑒定的蛋白質(zhì)可通過電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜或Edman降解法蛋白質(zhì)序列分析技術(shù)等進(jìn)行進(jìn)一步鑒定5.   在初步鑒定的17個(gè)差異蛋白質(zhì)中，癌組織中表達(dá)明顯增加的蛋白質(zhì)有10個(gè)，其中CDC27Hs蛋白與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)，有望作為抗HCC的治療靶標(biāo)；胰島素刺激蛋白激酶1（insulinstimulated pro

22、tein kinase1，ISPK1）能使絲裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）磷酸化而活化MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有研究認(rèn)為其與肝細(xì)胞癌變密切相關(guān). 核纖層蛋白B1能與蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的a調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，激活細(xì)胞核內(nèi)PKC依賴的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致多個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)的改變，與細(xì)胞的增殖和癌變密切相關(guān)，有望作為腫瘤治療的靶標(biāo)6. Cytoskeletal 8在腫瘤癌變機(jī)制中的意義尚不明確. Gankyrin推動細(xì)胞周期的進(jìn)展. 我們發(fā)現(xiàn)，Gankyrin表達(dá)增加出現(xiàn)在所有的癌組織2DE凝膠圖譜中，表明其可能

23、參與了HBV相關(guān)性HCC的早期癌變，也許可作為一個(gè)早期診斷的腫瘤標(biāo)記. Nucleolar phosphoprotein B23可能與細(xì)胞周期中中心粒的復(fù)制、Rb蛋白在核仁內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA損傷修復(fù)等有關(guān)7-9. 胞漿纖維蛋白重鏈（cytoplasmic dynein heavy chain）與細(xì)胞增殖、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān). cJun氨基端激酶（cJun Nterminal kinase 2，CJNK2）是MAPK家族中的一種；ADP/ATP carrier protein在癌變機(jī)制中的意義尚不清楚. 在癌組織中表達(dá)明顯降低的蛋白質(zhì)有7個(gè)，細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p12（cyclinde

24、pendent kinase inhibitor p12, p16INK4A）, 細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白1（cyclindependent kinase inhibitor 1, p21）、抗氧化蛋白2（antioxidant protein 2）, 二硫化蛋白異構(gòu)酶A2（Protein disulfide isomerase A2）, C1四氫葉酸合成酶、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（iInsulinlike growth factor binding protein 2）等.   慢性肝炎基礎(chǔ)上發(fā)生的癌變與肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的癌變，其癌變機(jī)制存在差別，對于某些在癌組織

25、或肝硬化組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)的蛋白質(zhì)，如ADP/ATP 運(yùn)輸?shù)鞍?，其在肝硬化組織中表達(dá)增強(qiáng)而在慢性肝炎組織中明顯減低，能否作為肝硬化的診斷標(biāo)記，值得進(jìn)一步研究.【參考文獻(xiàn)】  1 Lok AS, Heathcote EJ, Hoofnagle JH. Management of hepatitis B: 2000-summary of a workshopJ. Gastroenterology, 2001, 120:1828-1853.2 Srinivas PR, Verma M, Zhao Y, et al. Proteomics for cancer biomarker discoveryJ. Clin Chem, 2002, 48:1160-1169.3 Lok AS, McMahon BJ. Chronic hepatitis BJ. Hepatology, 2001, 34: 1225 -1241.4 Lee KH. Proteomics: A technologydriven and technologylimited discovery scienceJ. Trends Biotech, 2001, 19:217-222.5 Stensballe A, Jensen ON. Simplified sample preparation method for