基因工程應(yīng)用課件

1、1.1.技術(shù)解決化學(xué)技術(shù)解決化學(xué)( (生物生物) )工程問(wèn)工程問(wèn)題的基因工程策略題的基因工程策略n 傳統(tǒng)的化學(xué)工程的核心是所謂的傳統(tǒng)的化學(xué)工程的核心是所謂的“三三傳一反傳一反”，即：動(dòng)量傳遞、熱量傳遞、，即：動(dòng)量傳遞、熱量傳遞、質(zhì)量傳遞和反應(yīng)工程。質(zhì)量傳遞和反應(yīng)工程。n 在生物化學(xué)工程中，同樣存在著這些在生物化學(xué)工程中，同樣存在著這些問(wèn)題。目前，生物化工工作者，通常是問(wèn)題。目前，生物化工工作者，通常是通過(guò)物理或化學(xué)的方法來(lái)解決這些問(wèn)題通過(guò)物理或化學(xué)的方法來(lái)解決這些問(wèn)題的。的。問(wèn)題的提出n 例如，在生物好氧發(fā)酵過(guò)程中，例如，在生物好氧發(fā)酵過(guò)程中，氧的供應(yīng)是一個(gè)重要的問(wèn)題，因?yàn)檠醯墓?yīng)是一個(gè)重要的

2、問(wèn)題，因?yàn)檠踉谒芤褐械娜芙舛仁呛艿偷摹Ｑ踉谒芤褐械娜芙舛仁呛艿偷?。因此，保證供氧往往成為菌體生長(zhǎng)因此，保證供氧往往成為菌體生長(zhǎng)和代謝的限制性因素。尤其為了提和代謝的限制性因素。尤其為了提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本進(jìn)行高產(chǎn)品的產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本進(jìn)行大規(guī)模、高密度培養(yǎng)時(shí)，氧的供給大規(guī)模、高密度培養(yǎng)時(shí)，氧的供給和傳遞問(wèn)題就更加突出。和傳遞問(wèn)題就更加突出。一例生化工程問(wèn)題n 通常的方法是加強(qiáng)攪拌和加大通氣通常的方法是加強(qiáng)攪拌和加大通氣量，甚至通富氧或在發(fā)酵液中加入可量，甚至通富氧或在發(fā)酵液中加入可高溶氧的物質(zhì)（氧載體），來(lái)滿足菌高溶氧的物質(zhì)（氧載體），來(lái)滿足菌體對(duì)氧的需求。無(wú)疑，這些措施都會(huì)體對(duì)氧

3、的需求。無(wú)疑，這些措施都會(huì)增加能耗和生產(chǎn)成本。有時(shí)甚至仍達(dá)增加能耗和生產(chǎn)成本。有時(shí)甚至仍達(dá)n不到高密度培養(yǎng)的要求。不到高密度培養(yǎng)的要求。 因此，提因此，提高氧的利用率是生物發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)高氧的利用率是生物發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)的一大難題。的一大難題。n 又例如：生物化工中，大多數(shù)基因又例如：生物化工中，大多數(shù)基因工程產(chǎn)品是胞內(nèi)產(chǎn)物，即：產(chǎn)物積累工程產(chǎn)品是胞內(nèi)產(chǎn)物，即：產(chǎn)物積累在細(xì)胞內(nèi)。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵在細(xì)胞內(nèi)。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵后，需要破碎細(xì)胞、釋放胞內(nèi)產(chǎn)物。后，需要破碎細(xì)胞、釋放胞內(nèi)產(chǎn)物。n 破碎細(xì)胞是生物產(chǎn)品后處理中一個(gè)破碎細(xì)胞是生物產(chǎn)品后處理中一個(gè)比較特殊和麻煩的操作過(guò)程。比較特殊和麻

4、煩的操作過(guò)程。 又一例生化工程問(wèn)題n 傳統(tǒng)的細(xì)胞破碎方法傳統(tǒng)的細(xì)胞破碎方法有：有：n1 1、機(jī)械法、機(jī)械法、n2 2、溶劑萃取法、溶劑萃取法、n3 3、化學(xué)試劑法、化學(xué)試劑法、n4 4、酶法，等等。、酶法，等等。n 各種方法都有一定的各種方法都有一定的n缺陷和局限性。缺陷和局限性。n1 1、機(jī)械法機(jī)械法設(shè)備昂貴，產(chǎn)品變性；設(shè)備昂貴，產(chǎn)品變性；n2 2、溶劑萃取法溶劑萃取法溶劑回收，環(huán)境污染；溶劑回收，環(huán)境污染；n3 3、化學(xué)試劑法化學(xué)試劑法環(huán)境污染，產(chǎn)品變性；環(huán)境污染，產(chǎn)品變性；n4 4、酶法酶法n 操作復(fù)雜，操作復(fù)雜，n 條件苛刻，條件苛刻，n 需加外源酶。需加外源酶。n 生物技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)

5、，人們對(duì)此有生物技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)，人們對(duì)此有很高的期望，但是為什么生物技術(shù)沒(méi)很高的期望，但是為什么生物技術(shù)沒(méi)有在生產(chǎn)中得到預(yù)期那樣快的發(fā)展呢？有在生產(chǎn)中得到預(yù)期那樣快的發(fā)展呢？n 其原因很多，其原因很多，n其中一個(gè)重要的原因是生物技術(shù)本身其中一個(gè)重要的原因是生物技術(shù)本身在工程上存在著一些問(wèn)題。在工程上存在著一些問(wèn)題。生化產(chǎn)品生產(chǎn)中存在的問(wèn)題生化產(chǎn)品生產(chǎn)中存在的問(wèn)題n1 1、發(fā)酵成本高：、發(fā)酵成本高：n 培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成復(fù)雜，原料昂貴；組成復(fù)雜，原料昂貴；n 供氧供氧加強(qiáng)通氣加強(qiáng)通氣/ /攪拌，攪拌，能耗高能耗高，通純氧；，通純氧；n2 2、回收成本高：、回收成本高： n 產(chǎn)物濃度低；產(chǎn)物濃度低；

6、n 雜質(zhì)含量高；雜質(zhì)含量高；n 分離提取困難。分離提取困難。n3 3、廢物、廢水的、廢物、廢水的 處理問(wèn)題。處理問(wèn)題。生化產(chǎn)品生產(chǎn)中存在的問(wèn)題n 總起來(lái)：總起來(lái)：存在的主要問(wèn)題：存在的主要問(wèn)題：n在許多情況下，與其它生產(chǎn)法在許多情況下，與其它生產(chǎn)法n相比，往往生產(chǎn)成本較高相比，往往生產(chǎn)成本較高 。 基因工程的新作用n 隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展，可隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展，可以利用基因工程技術(shù)來(lái)解決化學(xué)以利用基因工程技術(shù)來(lái)解決化學(xué)工程的問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)工程的問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)和降低生產(chǎn)成本的目的。和降低生產(chǎn)成本的目的。n 這為基因工程的作用賦予了新這為基因工程的作用賦予了新的含意，即用基因

7、工程來(lái)解決化的含意，即用基因工程來(lái)解決化學(xué)工程問(wèn)題。學(xué)工程問(wèn)題。一個(gè)實(shí)例：n 以以聚聚-羥基丁酸酯（羥基丁酸酯（PHBPHB）n的生產(chǎn)為例：的生產(chǎn)為例：n這是一種用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的可生這是一種用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的可生物降解的高分子材料，它還具有生物物降解的高分子材料，它還具有生物相容性、壓電性及低透氧性等許多獨(dú)相容性、壓電性及低透氧性等許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。不僅可以在醫(yī)藥、電子等特的優(yōu)點(diǎn)。不僅可以在醫(yī)藥、電子等高技術(shù)領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用，并可望為解高技術(shù)領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用，并可望為解決日益嚴(yán)重的決日益嚴(yán)重的“白色污染白色污染”問(wèn)題帶來(lái)問(wèn)題帶來(lái)希望。希望。n 但是，如上所述的那樣，但是，如上所述的那樣，n 在

8、在PHBPHB生產(chǎn)中生產(chǎn)中存在的主要問(wèn)題也是：存在的主要問(wèn)題也是：n 成本較高。成本較高。n 其原因是：其原因是： n 發(fā)酵水平低；發(fā)酵水平低；n 發(fā)酵成本高：發(fā)酵成本高：n 回收成本高：回收成本高： n 細(xì)胞可控裂解細(xì)胞可控裂解E. coli cell 透明顫菌血紅蛋白基因透明顫菌血紅蛋白基因 噬菌體裂解基因噬菌體裂解基因PHB PHB 合成基因合成基因提高氧利用率提高氧利用率高產(chǎn)率高產(chǎn)率低成本低成本 新菌株構(gòu)建新菌株構(gòu)建 生產(chǎn)生產(chǎn)PHBPHB的基因工程策略的基因工程策略為提高合成為提高合成PHBPHB的能力：的能力： 利用大腸桿菌快速生長(zhǎng)和可利用廉價(jià)利用大腸桿菌快速生長(zhǎng)和可利用廉價(jià)碳源等優(yōu)

9、點(diǎn)，將合成碳源等優(yōu)點(diǎn)，將合成PHBPHB的基因在大腸桿的基因在大腸桿菌中克隆和表達(dá)，以達(dá)到提高產(chǎn)量、降菌中克隆和表達(dá)，以達(dá)到提高產(chǎn)量、降低成本的目的。低成本的目的。利用利用烈性噬茵體裂解細(xì)胞壁烈性噬茵體裂解細(xì)胞壁在菌體中添加烈性噬菌體可以有效地裂解細(xì)在菌體中添加烈性噬菌體可以有效地裂解細(xì)胞胞, ,破細(xì)胞壁。破細(xì)胞壁。1994 1994 年報(bào)道了用年報(bào)道了用T4 T4 噬菌體來(lái)裂解噬菌體來(lái)裂解E. E. colicoli 細(xì)胞的方法。但由于烈性噬菌體不可控細(xì)胞的方法。但由于烈性噬菌體不可控, ,它的引入它的引入和散布不但會(huì)污染生產(chǎn)環(huán)境和散布不但會(huì)污染生產(chǎn)環(huán)境, ,給后續(xù)的培養(yǎng)帶來(lái)很大的給后續(xù)的培

10、養(yǎng)帶來(lái)很大的麻煩麻煩, ,甚至?xí)：Φ骄N甚至?xí)：Φ骄N, ,所以通常情況下所以通常情況下, ,這種方法是這種方法是不可取的不可取的, ,也是不實(shí)用的。這方面的報(bào)道也很少也是不實(shí)用的。這方面的報(bào)道也很少利用溫和性噬菌體裂解細(xì)胞壁利用溫和性噬菌體裂解細(xì)胞壁利用溫和性噬菌體感染細(xì)胞利用溫和性噬菌體感染細(xì)胞,獲得溶源菌獲得溶源菌,進(jìn)而進(jìn)而通過(guò)外在條件的變化來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞裂解通過(guò)外在條件的變化來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞裂解,這種破細(xì)胞這種破細(xì)胞壁的方法壁的方法,由于其可控由于其可控,所以相對(duì)于用烈性噬菌體裂所以相對(duì)于用烈性噬菌體裂解細(xì)胞的方法來(lái)說(shuō)更具有吸引力。解細(xì)胞的方法來(lái)說(shuō)更具有吸引力。利用克隆噬菌體裂解基因的方法破

11、細(xì)胞壁利用克隆噬菌體裂解基因的方法破細(xì)胞壁在溫和性噬菌體中在溫和性噬菌體中, E. coli 的的噬菌體是目前研噬菌體是目前研究得最清楚的。在研究感染了究得最清楚的。在研究感染了噬菌體的噬菌體的E.coli 的裂解時(shí)發(fā)現(xiàn)的裂解時(shí)發(fā)現(xiàn),對(duì)細(xì)胞起裂解作用的主要是對(duì)細(xì)胞起裂解作用的主要是噬菌噬菌體體DNA 上裂解基因所編碼的酶。上裂解基因所編碼的酶。噬菌體的裂解噬菌體的裂解基因包括基因包括S、R 和和Rz 三個(gè)基因三個(gè)基因,其中其中R 基因的產(chǎn)基因的產(chǎn)物是一種可溶于水的轉(zhuǎn)糖基酶物是一種可溶于水的轉(zhuǎn)糖基酶( transglycosylase) ,可分解細(xì)胞壁的肽聚糖。該可分解細(xì)胞壁的肽聚糖。該酶與真正

12、的溶菌酶的不同之處在于酶與真正的溶菌酶的不同之處在于,它可以引起它可以引起肽鍵水解肽鍵水解,而溶菌酶卻只使肽聚糖上相鄰的而溶菌酶卻只使肽聚糖上相鄰的N2乙乙酰氨基葡萄糖殘基間裂開(kāi)。酰氨基葡萄糖殘基間裂開(kāi)。Rz 基因的產(chǎn)物可能是一種肽鏈內(nèi)切酶基因的產(chǎn)物可能是一種肽鏈內(nèi)切酶(endopeptidase) ,它可以切割肽聚糖的寡糖它可以切割肽聚糖的寡糖之間和之間和/或者肽聚糖與細(xì)胞壁外膜之間的交聯(lián)?；蛘唠木厶桥c細(xì)胞壁外膜之間的交聯(lián)。R 和和Rz 基因產(chǎn)物的功能是降解細(xì)胞壁基因產(chǎn)物的功能是降解細(xì)胞壁,而而S 基基因產(chǎn)物的作用是改變細(xì)胞質(zhì)膜的通透性因產(chǎn)物的作用是改變細(xì)胞質(zhì)膜的通透性,在細(xì)在細(xì)胞質(zhì)膜上形成

13、多孔的結(jié)構(gòu)胞質(zhì)膜上形成多孔的結(jié)構(gòu),以使以使R 和和Rz 基因產(chǎn)基因產(chǎn)生的酶可以穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜生的酶可以穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜,到達(dá)細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞壁,從而作從而作用于細(xì)胞壁用于細(xì)胞壁PHB biosynthetic genes (phbCAB) phbA -ketothiolase(-酮硫解酶酮硫解酶) phbB aceto-acetyl-CoA reductase(NADPH為輔酶的乙酰乙酰為輔酶的乙酰乙酰CoA還原酶還原酶) phbC PHB synthasePHB 合成基因來(lái)源于合成基因來(lái)源于：Alcaligenes eutrophus H16PHB 的合成的合成：為裂解細(xì)胞，釋放胞內(nèi)產(chǎn)物：為裂解細(xì)胞

14、，釋放胞內(nèi)產(chǎn)物： 將將噬菌體的裂解基因克隆在大腸桿噬菌體的裂解基因克隆在大腸桿菌中。使菌具有破壁溫和、可控、簡(jiǎn)單、菌中。使菌具有破壁溫和、可控、簡(jiǎn)單、無(wú)需加入外源酶等優(yōu)點(diǎn)。可降低分離回?zé)o需加入外源酶等優(yōu)點(diǎn)?？山档头蛛x回收的成本，且提高了收的成本，且提高了PHBPHB產(chǎn)品的質(zhì)量。產(chǎn)品的質(zhì)量。 琥珀突變的琥珀突變的噬菌體裂解基因噬菌體裂解基因（S-RRz）：）： 位于長(zhǎng)度為位于長(zhǎng)度為1466bp1466bp的的EcoEcoR-R- Cla ClaDNADNA片段上片段上 Lytic genes from phage (S-RRz)功能：編碼可裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的幾種酶功能：編碼可裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的幾種酶

15、 S S 改變細(xì)胞膜的通透性，形成多孔結(jié)構(gòu)；改變細(xì)胞膜的通透性，形成多孔結(jié)構(gòu)； R R 產(chǎn)生可溶于水的轉(zhuǎn)糖基酶，以分解細(xì)產(chǎn)生可溶于水的轉(zhuǎn)糖基酶，以分解細(xì) 胞壁的肽聚糖；胞壁的肽聚糖； Rz Rz 產(chǎn)生肽鏈內(nèi)切酶，可以切割肽聚糖寡產(chǎn)生肽鏈內(nèi)切酶，可以切割肽聚糖寡 糖間及肽聚糖與胞壁外膜間的交聯(lián)；糖間及肽聚糖與胞壁外膜間的交聯(lián)；特性：特性：S S 基因琥珀突變解決了細(xì)胞壁裂解與菌體基因琥珀突變解決了細(xì)胞壁裂解與菌體生長(zhǎng)和生長(zhǎng)和PHBPHB積累的矛盾。積累的矛盾。 Lytic genes from phage (S-RRz)質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒的構(gòu)建 為解決大規(guī)模、高密度培養(yǎng)時(shí)氧的為解決大規(guī)模、高密度培養(yǎng)

16、時(shí)氧的供需矛盾，提高菌體對(duì)氧的利用率：供需矛盾，提高菌體對(duì)氧的利用率： 在大腸桿菌中克隆和表達(dá)透明顫在大腸桿菌中克隆和表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因。具有這種基因的菌血紅蛋白基因。具有這種基因的菌株，能合成血紅蛋白，提高對(duì)氧菌株，能合成血紅蛋白，提高對(duì)氧的利用率和耐低溶氧的能力。從而的利用率和耐低溶氧的能力。從而降低發(fā)酵的成本。降低發(fā)酵的成本。透明顫菌血紅蛋白（透明顫菌血紅蛋白（VHbVHb）及其基因（）及其基因（vgbvgb）VHbVHb含含146146個(gè)氨基酸殘基，有兩個(gè)相對(duì)分子量為個(gè)氨基酸殘基，有兩個(gè)相對(duì)分子量為1577515775的亞基。的亞基。vgbvgb基因位于基因位于1.4kb1.4k

17、b的的Hind-SalHind-Sal片段上；片段上；Vitreoscilla hemogobin gene (vgb)VG1(pTU14)VG1(pTU14)中中vgb vgb 的表達(dá)的表達(dá)VG1(pTU14) VG1(pTU14) 細(xì)胞的細(xì)胞的COCO差光譜在差光譜在 419nm 419nm 處呈現(xiàn)出處呈現(xiàn)出明顯的透明顫菌血紅蛋白的特征吸收峰。明顯的透明顫菌血紅蛋白的特征吸收峰。說(shuō)明說(shuō)明vgbvgb可以在可以在VG1(pTU14)VG1(pTU14)成功表達(dá)。成功表達(dá)。1 JM105 (pTU14) 2 VG1 (pTU14)How about the expressions of the

18、 three exogenous genes in VG1 (pTU14)?用用2 mM EDTA / 50 mM Tris (pH 8.0) buffer2 mM EDTA / 50 mM Tris (pH 8.0) buffer處理前后處理前后VG1(pTU14)VG1(pTU14)細(xì)胞的電鏡觀察細(xì)胞的電鏡觀察22h culture, magnification: 6600VG1(pTU14)VG1(pTU14)中中 S S- -RRz RRz 基因的表達(dá)和調(diào)控基因的表達(dá)和調(diào)控VG1(pTU14)VG1(pTU14)的細(xì)胞和胞內(nèi)積累的的細(xì)胞和胞內(nèi)積累的PHBPHB顆粒顆粒 （裂解前）（裂解

19、前）從從VG1(pTU14)VG1(pTU14)細(xì)胞內(nèi)釋放出的細(xì)胞內(nèi)釋放出的PHBPHB顆粒顆粒 （裂解后）（裂解后）VG1(pTU14)VG1(pTU14)中中 S S- -RRz RRz 基因的表達(dá)基因的表達(dá)5 h58 h37 h11 hPHB PHB 大量積累時(shí)大量積累時(shí)VG1(pTU14)VG1(pTU14)細(xì)胞細(xì)胞的自動(dòng)裂解的自動(dòng)裂解Magnification： 160050 h010203040506070050100150200250X, P, R (g/L)Time (h) X P R020406080100 P/X P/X (%)在優(yōu)化條件下，經(jīng)過(guò)在優(yōu)化條件下，經(jīng)過(guò)6060小

20、時(shí)的補(bǔ)料分批培養(yǎng)，小時(shí)的補(bǔ)料分批培養(yǎng)， VG1(pTU14)VG1(pTU14)的細(xì)胞干重達(dá)到：的細(xì)胞干重達(dá)到：216g/L 216g/L ， PHBPHB濃度：濃度：194g/L194g/L， PHBPHB占細(xì)胞干重：占細(xì)胞干重：90 %90 % 達(dá)到了國(guó)際上文獻(xiàn)報(bào)道的高指標(biāo)達(dá)到了國(guó)際上文獻(xiàn)報(bào)道的高指標(biāo)。VG1(pTU14)VG1(pTU14)在發(fā)酵罐中的補(bǔ)料分批培養(yǎng)在發(fā)酵罐中的補(bǔ)料分批培養(yǎng)這是一個(gè)化學(xué)這是一個(gè)化學(xué)( (生物生物) )工程工作工程工作者能創(chuàng)新性地發(fā)揮作用的舞臺(tái)，者能創(chuàng)新性地發(fā)揮作用的舞臺(tái)，必將得到進(jìn)一步的發(fā)展。必將得到進(jìn)一步的發(fā)展。 蟲(chóng)害是制約農(nóng)作物高產(chǎn)的重要因素蟲(chóng)害是制約農(nóng)

21、作物高產(chǎn)的重要因素,世界每年因蟲(chóng)世界每年因蟲(chóng)害造成的損失約占農(nóng)作物總產(chǎn)量的害造成的損失約占農(nóng)作物總產(chǎn)量的15%以上?；陨稀；瘜W(xué)農(nóng)藥的施用在減少蟲(chóng)害的同時(shí)引起一系列副作學(xué)農(nóng)藥的施用在減少蟲(chóng)害的同時(shí)引起一系列副作用用,如提高成本、污染環(huán)境、誘導(dǎo)害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性、如提高成本、污染環(huán)境、誘導(dǎo)害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性、引起次要害蟲(chóng)的大發(fā)生等。引起次要害蟲(chóng)的大發(fā)生等。 而通過(guò)基因工程手段培育抗蟲(chóng)新品種而通過(guò)基因工程手段培育抗蟲(chóng)新品種(系系)可從根可從根本上解決問(wèn)題本上解決問(wèn)題,對(duì)哺乳動(dòng)物和一些有益昆蟲(chóng)不產(chǎn)生對(duì)哺乳動(dòng)物和一些有益昆蟲(chóng)不產(chǎn)生毒害作用毒害作用,且不造成環(huán)境污染且不造成環(huán)境污染,具有廣闊的應(yīng)用前具有廣闊的應(yīng)

22、用前景。景。 利用基因工程手段培育抗蟲(chóng)新品種有以下優(yōu)點(diǎn)利用基因工程手段培育抗蟲(chóng)新品種有以下優(yōu)點(diǎn): (1)保護(hù)作用具有連續(xù)性保護(hù)作用具有連續(xù)性; (2)基因資源非常豐富基因資源非常豐富; (3)對(duì)害蟲(chóng)的毒性具有專(zhuān)一性對(duì)害蟲(chóng)的毒性具有專(zhuān)一性; (4)對(duì)害蟲(chóng)的毒害作用可不受時(shí)，空的限制對(duì)害蟲(chóng)的毒害作用可不受時(shí)，空的限制; (5)不易被環(huán)境因素影響不易被環(huán)境因素影響,也不對(duì)環(huán)境造成污染也不對(duì)環(huán)境造成污染; (6)育種周期短育種周期短,成本低成本低,目的性強(qiáng)。目的性強(qiáng)。 1.1 來(lái)源于微生物的抗蟲(chóng)基因來(lái)源于微生物的抗蟲(chóng)基因 1.1.1 蘇云金桿菌毒蛋白基因蘇云金桿菌毒蛋白基因(Bt基因基因) Bt是蘇云

23、金桿菌是蘇云金桿菌Bacillus thuringiensi的簡(jiǎn)稱(chēng)的簡(jiǎn)稱(chēng),是一種革蘭氏陽(yáng)性土壤芽胞桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性土壤芽胞桿菌,其殺蟲(chóng)毒性來(lái)其殺蟲(chóng)毒性來(lái)自芽孢形成時(shí)所產(chǎn)生的具有自芽孢形成時(shí)所產(chǎn)生的具有高度特異性高度特異性殺蟲(chóng)活性殺蟲(chóng)活性的晶體蛋白的晶體蛋白,通常稱(chēng)為蘇云金桿菌毒蛋白通常稱(chēng)為蘇云金桿菌毒蛋白(Bt toxic protein) 、殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白、殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白(insecticidal crystal protein,ICP) 、 內(nèi)毒素等。內(nèi)毒素等。 通過(guò)克隆技術(shù)確定通過(guò)克隆技術(shù)確定Bt基因位于基因位于30150MD大小大小不同的質(zhì)粒上不同的質(zhì)粒上,其中毒性區(qū)間位于該序列其中毒

24、性區(qū)間位于該序列N端端29607個(gè)編碼區(qū)個(gè)編碼區(qū),C端有高度的保守性端有高度的保守性,對(duì)穩(wěn)定晶對(duì)穩(wěn)定晶體蛋白結(jié)構(gòu)可能起著重要作用。體蛋白結(jié)構(gòu)可能起著重要作用。 殺蟲(chóng)機(jī)理殺蟲(chóng)機(jī)理:其中其中,應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要是應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要是內(nèi)毒素內(nèi)毒素。已知。已知內(nèi)毒素為內(nèi)毒素為130160KD的多的多肽肽,在伴孢晶體內(nèi)是以原毒素的形式存在在伴孢晶體內(nèi)是以原毒素的形式存在,經(jīng)經(jīng)體外堿解或在昆蟲(chóng)腸道內(nèi)被蛋白酶水解成體外堿解或在昆蟲(chóng)腸道內(nèi)被蛋白酶水解成5570KD或更小的多肽或更小的多肽,與敏感昆蟲(chóng)中腸道與敏感昆蟲(chóng)中腸道上皮紋緣細(xì)胞上的特異受體位點(diǎn)結(jié)合上皮紋緣細(xì)胞上的特異受體位點(diǎn)結(jié)合,并破并破壞紋緣膜細(xì)胞

25、滲透壓平衡壞紋緣膜細(xì)胞滲透壓平衡,使細(xì)胞裂解使細(xì)胞裂解,殺死殺死昆蟲(chóng)。昆蟲(chóng)。 分類(lèi)分類(lèi):不同基因型殺蟲(chóng)譜不同不同基因型殺蟲(chóng)譜不同,毒蛋白的大小及形毒蛋白的大小及形狀也不一樣。根據(jù)殺蟲(chóng)譜的不同狀也不一樣。根據(jù)殺蟲(chóng)譜的不同,將殺蟲(chóng)基因分成將殺蟲(chóng)基因分成六大類(lèi)六大類(lèi),統(tǒng)稱(chēng)為統(tǒng)稱(chēng)為Cry基因基因,用羅馬數(shù)字用羅馬數(shù)字，等來(lái)命名等來(lái)命名,分別代表幾種殺蟲(chóng)范圍。分別代表幾種殺蟲(chóng)范圍。 在煙草中進(jìn)行了在在煙草中進(jìn)行了在后代中刪除后代中刪除Bt基基因的實(shí)驗(yàn)，因的實(shí)驗(yàn)， PCR鑒定證明轉(zhuǎn)基因煙鑒定證明轉(zhuǎn)基因煙草后代中草后代中Bt基因基因已被刪除。已被刪除。 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了生物抗蟲(chóng)性試驗(yàn)，了生

26、物抗蟲(chóng)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示結(jié)果顯示,未含有未含有Bt基因的煙草棉鈴基因的煙草棉鈴蟲(chóng)不會(huì)被殺死，而蟲(chóng)不會(huì)被殺死，而含有含有Bt基因的煙草基因的煙草則毒殺了棉鈴蟲(chóng)。則毒殺了棉鈴蟲(chóng)。由中國(guó)農(nóng)科院生物工程中心開(kāi)發(fā)的Bt棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)有顯著的抗性。與對(duì)照相比減少農(nóng)藥用量80，并減少用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。 1.1.2 其他來(lái)源于微生物的抗蟲(chóng)基因其他來(lái)源于微生物的抗蟲(chóng)基因 來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的異戊烯轉(zhuǎn)移酶異戊烯轉(zhuǎn)移酶(IPT)基基因因編碼細(xì)胞分裂素生物合成途徑中的一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶關(guān)鍵酶,在煙草，番茄中表達(dá)后在

27、煙草，番茄中表達(dá)后,可減少煙草可減少煙草夜蛾對(duì)葉片的損傷夜蛾對(duì)葉片的損傷,并降低桃蚜的生存力。并降低桃蚜的生存力。 膽固醇對(duì)細(xì)胞膜的完整性和功能是必需的。膽固醇對(duì)細(xì)胞膜的完整性和功能是必需的。來(lái)源于鏈霉菌類(lèi)的來(lái)源于鏈霉菌類(lèi)的膽固醇氧化酶膽固醇氧化酶對(duì)棉鈴象對(duì)棉鈴象甲幼蟲(chóng)有極高的毒性甲幼蟲(chóng)有極高的毒性,并能延緩美洲煙草夜并能延緩美洲煙草夜蛾的生長(zhǎng)。蛾的生長(zhǎng)。 目前目前,從高等植物獲得的抗蟲(chóng)物質(zhì)主要有兩從高等植物獲得的抗蟲(chóng)物質(zhì)主要有兩大類(lèi)大類(lèi): 一類(lèi)是一類(lèi)是動(dòng)物消化酶的抑制劑動(dòng)物消化酶的抑制劑(包括蛋白酶抑包括蛋白酶抑制劑和淀粉酶抑制劑制劑和淀粉酶抑制劑); 另一類(lèi)是另一類(lèi)是植物凝集素植物凝集素。

28、 1.2.1 蛋白酶抑制劑類(lèi)抗蟲(chóng)基因蛋白酶抑制劑類(lèi)抗蟲(chóng)基因 蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑(PI)基因表達(dá)基因表達(dá)的蛋白酶抑制劑是的蛋白酶抑制劑是一類(lèi)存在于許多植物的貯藏器官一類(lèi)存在于許多植物的貯藏器官(如種子和塊莖如種子和塊莖中中)的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì),最早發(fā)現(xiàn)于最早發(fā)現(xiàn)于1938年年,其含量高達(dá)總其含量高達(dá)總蛋白的蛋白的1%10%。昆蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白酶負(fù)責(zé)食物。昆蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白酶負(fù)責(zé)食物中蛋白質(zhì)的消化中蛋白質(zhì)的消化,將蛋白酶抑制劑基因引入植物將蛋白酶抑制劑基因引入植物,即可通過(guò)影響昆蟲(chóng)的消化作用而致昆蟲(chóng)死亡即可通過(guò)影響昆蟲(chóng)的消化作用而致昆蟲(chóng)死亡 。 優(yōu)點(diǎn)：具有抗蟲(chóng)譜廣，對(duì)人畜無(wú)副作用及昆蟲(chóng)優(yōu)點(diǎn)：具有抗蟲(chóng)譜

29、廣，對(duì)人畜無(wú)副作用及昆蟲(chóng)不易產(chǎn)生耐受性等，是一類(lèi)天然的抗蟲(chóng)物質(zhì)。不易產(chǎn)生耐受性等，是一類(lèi)天然的抗蟲(chóng)物質(zhì)。 1.2.2 植物凝集素基因植物凝集素基因 外源凝集素基因是一類(lèi)糖結(jié)合蛋白外源凝集素基因是一類(lèi)糖結(jié)合蛋白,在自然在自然界中分布十分廣泛界中分布十分廣泛,是植物防御系統(tǒng)的一個(gè)是植物防御系統(tǒng)的一個(gè)組成部分。組成部分。 凝集素抗蟲(chóng)的作用機(jī)制可能是在昆蟲(chóng)腸腔凝集素抗蟲(chóng)的作用機(jī)制可能是在昆蟲(chóng)腸腔部位與糖蛋白結(jié)合部位與糖蛋白結(jié)合,降低膜透性降低膜透性,從而影響營(yíng)從而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收,同時(shí)誘發(fā)病灶同時(shí)誘發(fā)病灶,促進(jìn)消化促進(jìn)消化道內(nèi)細(xì)菌繁殖道內(nèi)細(xì)菌繁殖,使昆蟲(chóng)得病或引起拒食，生使昆蟲(chóng)得

30、病或引起拒食，生長(zhǎng)停滯甚至死亡長(zhǎng)停滯甚至死亡 動(dòng)物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因主要有動(dòng)物來(lái)源的抗蟲(chóng)基因主要有4類(lèi)類(lèi),一是絲氨酸一是絲氨酸(Ser)蛋白酶抑制劑基因蛋白酶抑制劑基因,二是昆蟲(chóng)毒素基因二是昆蟲(chóng)毒素基因,三是幾丁三是幾丁質(zhì)酶基因質(zhì)酶基因,四是體激素基因。四是體激素基因。 現(xiàn)在人們發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在人們發(fā)現(xiàn),來(lái)源于哺乳動(dòng)物和煙草夜蛾的來(lái)源于哺乳動(dòng)物和煙草夜蛾的Ser蛋白酶抑制劑是很有發(fā)展前景的抗蟲(chóng)蛋白。而來(lái)蛋白酶抑制劑是很有發(fā)展前景的抗蟲(chóng)蛋白。而來(lái)源于蝎子，蜘蛛，胡蜂，螞蟻等捕食性動(dòng)物的昆源于蝎子，蜘蛛，胡蜂，螞蟻等捕食性動(dòng)物的昆蟲(chóng)毒素基因編碼的蛋白分子量小蟲(chóng)毒素基因編碼的蛋白分子量小,這些毒素一般都這些毒素

31、一般都能專(zhuān)一性作用于昆蟲(chóng)而對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)害或毒性很能專(zhuān)一性作用于昆蟲(chóng)而對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)害或毒性很小小,這些毒素基因也已開(kāi)始應(yīng)用于基因工程這些毒素基因也已開(kāi)始應(yīng)用于基因工程 。 利用基因工程改善棉纖維的方法主要有兩種基本途利用基因工程改善棉纖維的方法主要有兩種基本途徑：徑： 一是增加或減少與某些棉纖維品質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)或酶的一是增加或減少與某些棉纖維品質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)或酶的表達(dá)水平。這一途徑需要分離鑒定出與棉纖維相關(guān)的基表達(dá)水平。這一途徑需要分離鑒定出與棉纖維相關(guān)的基因。目前的工作主要是試圖分離鑒定那些僅在或主要在因。目前的工作主要是試圖分離鑒定那些僅在或主要在纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因。一般認(rèn)為在纖維細(xì)胞內(nèi)特意

32、表達(dá)纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因。一般認(rèn)為在纖維細(xì)胞內(nèi)特意表達(dá)的基因可能對(duì)纖維發(fā)育起重要作用。的基因可能對(duì)纖維發(fā)育起重要作用。 二。從其他生物中選擇有潛力的基因，將其導(dǎo)入棉花，二。從其他生物中選擇有潛力的基因，將其導(dǎo)入棉花，以提高棉纖維品質(zhì)。例如以提高棉纖維品質(zhì)。例如PHB（聚羥基丁酸）是理化性（聚羥基丁酸）是理化性質(zhì)類(lèi)似聚丙烯的天然可降解的熱塑性化合物，許多細(xì)菌質(zhì)類(lèi)似聚丙烯的天然可降解的熱塑性化合物，許多細(xì)菌可產(chǎn)生該物質(zhì)，由于其天然可降解，所以不會(huì)產(chǎn)生污染?？僧a(chǎn)生該物質(zhì)，由于其天然可降解，所以不會(huì)產(chǎn)生污染。研究表明轉(zhuǎn)基因棉花纖維在彈性和強(qiáng)度上發(fā)生有益變化。研究表明轉(zhuǎn)基因棉花纖維在彈性和強(qiáng)度上發(fā)生有益變

33、化。 無(wú)論是哪種來(lái)源的抗蟲(chóng)基因用于基因工程無(wú)論是哪種來(lái)源的抗蟲(chóng)基因用于基因工程首要考慮的問(wèn)題就是首要考慮的問(wèn)題就是提高其表達(dá)量提高其表達(dá)量。一般。一般來(lái)說(shuō)來(lái)說(shuō),表達(dá)量越高表達(dá)量越高,抗蟲(chóng)效果就越好?？瓜x(chóng)效果就越好。 導(dǎo)入的抗蟲(chóng)基因翻譯水平不高是普遍存在導(dǎo)入的抗蟲(chóng)基因翻譯水平不高是普遍存在的問(wèn)題的問(wèn)題,因此因此,如何提高外源抗蟲(chóng)基因在植物如何提高外源抗蟲(chóng)基因在植物體內(nèi)的表達(dá)體內(nèi)的表達(dá),是植物抗蟲(chóng)基因工程的一個(gè)重是植物抗蟲(chóng)基因工程的一個(gè)重要研究方向。為此要研究方向。為此,科研工作者已嘗試從幾科研工作者已嘗試從幾條途徑來(lái)提高抗蟲(chóng)基因的表達(dá)。條途徑來(lái)提高抗蟲(chóng)基因的表達(dá)。 1 .對(duì)非必需區(qū)段進(jìn)行缺失處理

34、對(duì)非必需區(qū)段進(jìn)行缺失處理 2 .基因改造基因改造 3 .利用定位信號(hào)提高基因表達(dá)利用定位信號(hào)提高基因表達(dá) 4 .利用基質(zhì)結(jié)合區(qū)提高基因表達(dá)利用基質(zhì)結(jié)合區(qū)提高基因表達(dá) 5 .葉綠體轉(zhuǎn)化葉綠體轉(zhuǎn)化 6 .改進(jìn)改進(jìn)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的啟動(dòng)子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的啟動(dòng)子 Bt基因含有較多的基因含有較多的AT堿基和堿基和ATTTA重復(fù)序列。重復(fù)序列。AT富含富含區(qū)在高等植物中被認(rèn)為是不能表達(dá)的內(nèi)含子區(qū)在高等植物中被認(rèn)為是不能表達(dá)的內(nèi)含子,ATTTA重重復(fù)序列的復(fù)序列的mRNA的穩(wěn)定性差的穩(wěn)定性差,二者都不能在高等植物中二者都不能在高等植物中編碼。此外編碼。此外,Bt基因中的偏愛(ài)密碼子與植物中的不同基因中的偏愛(ài)密碼

35、子與植物中的不同,以以及其中存在的一些不穩(wěn)定元件如及其中存在的一些不穩(wěn)定元件如poly(A)信號(hào)序列、切信號(hào)序列、切割序列、終止序列等都直接影響著割序列、終止序列等都直接影響著B(niǎo)t基因在植物中的基因在植物中的mRNA特性。特性。 為此為此, 從兩條途徑對(duì)原基因進(jìn)行了改造。從兩條途徑對(duì)原基因進(jìn)行了改造。 第一條途徑是改進(jìn)第一條途徑是改進(jìn)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的啟動(dòng)子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的啟動(dòng)子,加入加入帶有帶有SV40復(fù)制增強(qiáng)子區(qū)的復(fù)制增強(qiáng)子區(qū)的35S啟動(dòng)子或重復(fù)的強(qiáng)化表啟動(dòng)子或重復(fù)的強(qiáng)化表達(dá)區(qū)達(dá)區(qū)(duplicated enhanced region),發(fā)現(xiàn)改建后的載發(fā)現(xiàn)改建后的載體表達(dá)量比原先提高了體表達(dá)

36、量比原先提高了510倍。倍。 第二條途徑是根據(jù)植物偏愛(ài)的密碼子對(duì)野生型第二條途徑是根據(jù)植物偏愛(ài)的密碼子對(duì)野生型(WT)Bt基因基因cryA(b)進(jìn)行部分改造或人工全合成進(jìn)行部分改造或人工全合成 。 Perlak等對(duì)等對(duì)WTcryA(b)（野生型）的（野生型）的AT富含區(qū)進(jìn)富含區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變行點(diǎn)突變,改變其中改變其中63個(gè)堿基對(duì)個(gè)堿基對(duì),AT含量由含量由63%下降下降至至59%,而而ATTTA重復(fù)序列也從重復(fù)序列也從13個(gè)減少至個(gè)減少至7個(gè)個(gè),部分部分改造后的基因稱(chēng)為改造后的基因稱(chēng)為PM cryA(b)。PM cryA(b)基因在轉(zhuǎn)化的煙草和番茄中的表達(dá)量為基因在轉(zhuǎn)化的煙草和番茄中的表達(dá)量為110

37、ng/50g植物可溶總蛋白植物可溶總蛋白,比比WTcryA(b)在轉(zhuǎn)在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量基因植物中的表達(dá)量(lng/50g)提高了提高了10倍。倍。 進(jìn)一步在不改變編碼的氨基酸序列的前提下進(jìn)一步在不改變編碼的氨基酸序列的前提下,幾乎更幾乎更換掉換掉WT基因中的所有不穩(wěn)定元件基因中的所有不穩(wěn)定元件,同時(shí)盡可能將其同時(shí)盡可能將其中的密碼子換成植物優(yōu)化密碼子中的密碼子換成植物優(yōu)化密碼子,AT含量下降至含量下降至51%,去掉所有去掉所有ATTTA序列。全合成的基因稱(chēng)為序列。全合成的基因稱(chēng)為FM cryA(b)，用其轉(zhuǎn)化煙草和番茄，用其轉(zhuǎn)化煙草和番茄,10%以上的轉(zhuǎn)化以上的轉(zhuǎn)化植株表達(dá)量達(dá)植株表達(dá)量達(dá)

38、30100ng50g植物可溶總蛋白植物可溶總蛋白,最高最高的可達(dá)的可達(dá)100150ng50g,比比WT cryA(b)的表達(dá)量的表達(dá)量提高提高50100倍倍,表現(xiàn)較強(qiáng)的殺蟲(chóng)效果。表現(xiàn)較強(qiáng)的殺蟲(chóng)效果。 目前目前,轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物的研究已取得很大進(jìn)轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物的研究已取得很大進(jìn)展展, 并在生產(chǎn)上展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。并在生產(chǎn)上展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。 但轉(zhuǎn)基因的抗蟲(chóng)植物在應(yīng)用中的潛在問(wèn)題但轉(zhuǎn)基因的抗蟲(chóng)植物在應(yīng)用中的潛在問(wèn)題也日益凸顯也日益凸顯,主要有殺蟲(chóng)蛋白主要有殺蟲(chóng)蛋白基因基因在植物體在植物體內(nèi)的內(nèi)的沉默沉默;昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)蛋白昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性產(chǎn)生抗性;轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物存在潛在的基因植物

39、存在潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性等。等。 3.1 抗蟲(chóng)基因的基因沉默抗蟲(chóng)基因的基因沉默 目前目前,已發(fā)現(xiàn)基因沉默與轉(zhuǎn)基因在受體植物中已發(fā)現(xiàn)基因沉默與轉(zhuǎn)基因在受體植物中甲基化甲基化狀況，轉(zhuǎn)基因的狀況，轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)拷貝數(shù)，插入插入受體植物染色體受體植物染色體位點(diǎn)位點(diǎn)及轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因是否是否與受體植物與受體植物存在同源基因存在同源基因等因素有關(guān)。等因素有關(guān)。 減少基因沉默的主要對(duì)策有減少基因沉默的主要對(duì)策有:基因改造基因改造,降低其與寄主降低其與寄主基因的同源性基因的同源性;采用低拷貝數(shù)采用低拷貝數(shù)(最好是單拷貝最好是單拷貝)的載體的載體;利用植物基因中相應(yīng)的增強(qiáng)子利用植物基因中相應(yīng)的增強(qiáng)子,構(gòu)建嵌

40、合基因構(gòu)建嵌合基因;用葉綠用葉綠體轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化;利用基質(zhì)結(jié)合區(qū)利用基質(zhì)結(jié)合區(qū)(Matrix attachment region,MAR)增強(qiáng)外源基因表達(dá)穩(wěn)定性增強(qiáng)外源基因表達(dá)穩(wěn)定性;在載體上加在載體上加上有去甲基化功能的序列以防止甲基化上有去甲基化功能的序列以防止甲基化 。 3.2 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因工程中昆蟲(chóng)的抗性問(wèn)題抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因工程中昆蟲(chóng)的抗性問(wèn)題 害蟲(chóng)的抗性是指害蟲(chóng)的抗性是指一個(gè)種群在遺傳基礎(chǔ)上降低了對(duì)某一個(gè)種群在遺傳基礎(chǔ)上降低了對(duì)某一種殺蟲(chóng)劑的敏感性一種殺蟲(chóng)劑的敏感性。雖然昆蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的抗。雖然昆蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的抗性發(fā)展緩慢性發(fā)展緩慢,但也是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因植但也是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題

41、。轉(zhuǎn)基因植物的大田抗性試驗(yàn)證明物的大田抗性試驗(yàn)證明,經(jīng)經(jīng)12次繁殖后昆蟲(chóng)便對(duì)次繁殖后昆蟲(chóng)便對(duì)Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性毒蛋白產(chǎn)生抗性,轉(zhuǎn)單一轉(zhuǎn)單一ICP基因的植物在生產(chǎn)上一基因的植物在生產(chǎn)上一般只能用般只能用810年。年。 由此看來(lái)由此看來(lái),昆蟲(chóng)的抗性是抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因工程中較為嚴(yán)重昆蟲(chóng)的抗性是抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因工程中較為嚴(yán)重的潛在問(wèn)題的潛在問(wèn)題,因此如何防止或延緩害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性因此如何防止或延緩害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性,這這已經(jīng)成為植物抗蟲(chóng)基因工程的另一重要研究?jī)?nèi)容。已經(jīng)成為植物抗蟲(chóng)基因工程的另一重要研究?jī)?nèi)容。 3.3 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因植物的安全性是一個(gè)長(zhǎng)期，重要而且轉(zhuǎn)抗

42、蟲(chóng)基因植物的安全性是一個(gè)長(zhǎng)期，重要而且復(fù)雜的問(wèn)題復(fù)雜的問(wèn)題,應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待?？瓜x(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的直接應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待?？瓜x(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的直接生態(tài)效應(yīng)是對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)種群的控制生態(tài)效應(yīng)是對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)種群的控制,但靶標(biāo)昆蟲(chóng)有但靶標(biāo)昆蟲(chóng)有無(wú)向其他寄主植物轉(zhuǎn)移的可能無(wú)向其他寄主植物轉(zhuǎn)移的可能;害蟲(chóng)天敵種群會(huì)受害蟲(chóng)天敵種群會(huì)受到怎樣的影響到怎樣的影響;次要害蟲(chóng)是否會(huì)變?yōu)橹饕οx(chóng)次要害蟲(chóng)是否會(huì)變?yōu)橹饕οx(chóng);靠靠轉(zhuǎn)基因作物的逃逸或從作物雜交中獲取轉(zhuǎn)基因抗轉(zhuǎn)基因作物的逃逸或從作物雜交中獲取轉(zhuǎn)基因抗性的植物是否會(huì)對(duì)自然植物群落產(chǎn)生嚴(yán)重影響都性的植物是否會(huì)對(duì)自然植物群落產(chǎn)生嚴(yán)重影響都是需進(jìn)一步研究的問(wèn)題。是需進(jìn)一步研究的問(wèn)題。 指通過(guò)

43、微細(xì)加工工藝在固體芯片表面構(gòu)建的微型指通過(guò)微細(xì)加工工藝在固體芯片表面構(gòu)建的微型化學(xué)分析系統(tǒng)化學(xué)分析系統(tǒng),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以以及其他生物組分的準(zhǔn)確快速與大信息量的檢測(cè)。及其他生物組分的準(zhǔn)確快速與大信息量的檢測(cè)。常用的生物芯片分為三大類(lèi)常用的生物芯片分為三大類(lèi): 1 基因芯片基因芯片(Genechip,DNAchip,DNAmicroarray) 2 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(Proteinchip) 3芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip) 又稱(chēng)又稱(chēng)DNA芯片，是專(zhuān)門(mén)用于核酸檢測(cè)的生物芯片，芯片，是專(zhuān)門(mén)用于核酸檢測(cè)的生物芯片，也是目前應(yīng)用最廣泛的微陣

44、列芯片。它是指在固相也是目前應(yīng)用最廣泛的微陣列芯片。它是指在固相載體上按照特定的排列方式固定上大量的載體上按照特定的排列方式固定上大量的 DNA片片斷，形成斷，形成DNA微矩陣。將樣品基因組微矩陣。將樣品基因組DNA/RNA通通過(guò)體外逆轉(zhuǎn)錄，過(guò)體外逆轉(zhuǎn)錄，PCR/RT-PCR擴(kuò)增等技術(shù)摻入標(biāo)記擴(kuò)增等技術(shù)摻入標(biāo)記分子后，與位于微陣列上的已知序列雜交，通過(guò)激分子后，與位于微陣列上的已知序列雜交，通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，檢測(cè)雜光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和綜合分交信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和綜合分析后，即可獲得樣品中大量

45、基因序列特征或基因表析后，即可獲得樣品中大量基因序列特征或基因表達(dá)特征信息。達(dá)特征信息。 基因芯片檢測(cè)的最一般原理仍然是基于堿基互補(bǔ)基因芯片檢測(cè)的最一般原理仍然是基于堿基互補(bǔ)的核酸分子雜交，相對(duì)與的核酸分子雜交，相對(duì)與Southern印記法印記法 ，Northern印記法而言，基因芯片是一種反向雜交印記法而言，基因芯片是一種反向雜交技術(shù)，把大量的技術(shù)，把大量的 已知序列的基因探針有序的固定已知序列的基因探針有序的固定到固相介質(zhì)上，這樣每個(gè)點(diǎn)實(shí)際上就代表了某個(gè)到固相介質(zhì)上，這樣每個(gè)點(diǎn)實(shí)際上就代表了某個(gè)特定的基因，然后把樣品中的靶基因特定的基因，然后把樣品中的靶基因（DNA/RNA/MRNA)進(jìn)行

46、標(biāo)記，與基因進(jìn)行常規(guī)進(jìn)行標(biāo)記，與基因進(jìn)行常規(guī)的分子雜交，從而對(duì)基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模，的分子雜交，從而對(duì)基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模，高通量的研究。高通量的研究。 芯片種類(lèi)較多，制備方法也不盡相同，常芯片種類(lèi)較多，制備方法也不盡相同，常見(jiàn)的芯片可分為兩大類(lèi)：見(jiàn)的芯片可分為兩大類(lèi)： 1.原位合成法原位合成法 2.直接點(diǎn)樣法直接點(diǎn)樣法 原位合成適用于寡核苷酸原位合成適用于寡核苷酸.原位合成有兩種原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合成刻法可以合成30nt左右，噴印法可以合成左右，噴印法可以合成40-50nt，光蝕刻法每步縮合率較低，一般，光蝕

47、刻法每步縮合率較低，一般為為95%左右，合成左右，合成30nt產(chǎn)率僅產(chǎn)率僅20%；噴??；噴印法可達(dá)法可達(dá)99%以上，合成以上，合成30nt產(chǎn)率可達(dá)產(chǎn)率可達(dá)74%，從這個(gè)意義上說(shuō)噴印法特異性應(yīng)比光刻法從這個(gè)意義上說(shuō)噴印法特異性應(yīng)比光刻法高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。 點(diǎn)樣法是將合成好的探針、點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cNDA或基因組或基因組DNA通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)采用

48、人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的的DNA芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費(fèi)時(shí)芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大規(guī)模費(fèi)力，不適于大規(guī)模DNA芯片制作，因而實(shí)現(xiàn)自芯片制作，因而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化點(diǎn)樣就顯得尤為重要。動(dòng)化點(diǎn)樣就顯得尤為重要。 （一）基因表達(dá)分析基因芯片具有高度的敏感性（一）基因表達(dá)分析基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞中幾個(gè)至幾千個(gè)和特異性，它可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞中幾個(gè)至幾千個(gè)mRNA拷貝的轉(zhuǎn)錄情

49、況拷貝的轉(zhuǎn)錄情況 （二）基因型、基因突變和多態(tài)性分析（二）基因型、基因突變和多態(tài)性分析 在同一物在同一物種不同種群和個(gè)體之間，有著多種不同的基因型，種不同種群和個(gè)體之間，有著多種不同的基因型，而這種不同，往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性而這種不同，往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)大量具有不同性狀的疾病有著密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較，就可以得出基因與性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。用基因芯片可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基關(guān)系。用基因芯片可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性因的特性，我

50、們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系。狀或疾病的關(guān)系。 （三）疾病的診斷與治療人類(lèi)的疾病與遺傳（三）疾病的診斷與治療人類(lèi)的疾病與遺傳基因密切相關(guān)，基因芯片可以對(duì)遺傳信息進(jìn)行基因密切相關(guān)，基因芯片可以對(duì)遺傳信息進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析，因此它在疾病的分子診斷中快速準(zhǔn)確的分析，因此它在疾病的分子診斷中的優(yōu)勢(shì)是不言而喻的，就臨床一種新的、強(qiáng)有的優(yōu)勢(shì)是不言而喻的，就臨床一種新的、強(qiáng)有力的分子工具。基因芯片技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于感力的分子工具?；蛐酒夹g(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方面的研究。染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方面的研究。（四）藥物研究中的應(yīng)用（四）藥物研究中的應(yīng)用從經(jīng)濟(jì)效益來(lái)說(shuō)，最

51、大的應(yīng)用領(lǐng)域可能是制藥廠用來(lái)從經(jīng)濟(jì)效益來(lái)說(shuō)，最大的應(yīng)用領(lǐng)域可能是制藥廠用來(lái)開(kāi)發(fā)新藥。所以已經(jīng)有多家制藥企業(yè)介入芯片的開(kāi)發(fā)。開(kāi)發(fā)新藥。所以已經(jīng)有多家制藥企業(yè)介入芯片的開(kāi)發(fā)。如：如： Incyte Pharmaaceuticals Inc.，Sequana Therapeutics，Millenium Pharmaceuticals Inc.等。等。對(duì)于尋找新藥來(lái)說(shuō)，目標(biāo)之一是應(yīng)用芯片可以在基因?qū)τ趯ふ倚滤巵?lái)說(shuō)，目標(biāo)之一是應(yīng)用芯片可以在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)。采用所謂水平上尋找藥物靶標(biāo)。采用所謂“譯碼器譯碼器”策略策略（Decoder strategy）來(lái)確定藥物靶標(biāo)。從而找到）來(lái)確定藥物靶標(biāo)。從而找到“導(dǎo)向藥物導(dǎo)向藥物”?；蛐酒脖挥糜趯ふ业鞍准っ敢种?。基因芯片也被用于尋找蛋白激酶抑制物。細(xì)菌或腫瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用物。細(xì)菌或腫瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用DNA芯片鑒定。芯片鑒定。 1 新藥開(kāi)發(fā)高通量的新藥開(kāi)發(fā)高通量