水溶性酵母葡聚糖的制備及應(yīng)用研究進(jìn)展

1、水溶性酵母葡聚糖的制備及應(yīng)用研究進(jìn)展摘要:啤酒酵母葡聚糖是一類免疫多糖,參與生物細(xì)胞的多種生命調(diào)節(jié),可激活免疫細(xì)胞,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,具抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤等功能,且毒副作用低,被稱為生物效應(yīng)應(yīng)答劑。近年來,越來越多的學(xué)者開始研究和開發(fā)酵母葡聚糖。論文對酵母葡聚糖的結(jié)構(gòu)、提取方法、結(jié)構(gòu)修飾和應(yīng)用進(jìn)行了簡述,對提取方法和結(jié)構(gòu)修飾中的各種方法進(jìn)行了綜合比較和分析;并重點(diǎn)介紹了提高酵母葡聚糖的水溶性的方法及相對應(yīng)的鑒定方法,這將為酵母葡聚糖的開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。除此之外,論文還對酵母葡聚糖的進(jìn)一步開發(fā)利用進(jìn)行了展望。關(guān)鍵字:酵母葡聚糖;提取方法;分子修飾;鑒定啤酒酵母葡聚糖是從啤酒酵母細(xì)胞

2、壁中提取的一種葡萄糖聚合物,因?yàn)樗哂性鰪?qiáng)免疫功能的能力,被譽(yù)為是生物效應(yīng)應(yīng)答劑1。研究表明,啤酒酵母葡聚糖對哺乳動(dòng)物的特異性和非特異性免疫功能均有刺激作用2,可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對多種病原,如細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲等的免疫反應(yīng),進(jìn)而提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對病原體侵入的抵抗力。但由于酵母葡聚糖難溶于水和純度低等原因,限制了它作為藥物在生產(chǎn)中的應(yīng)用,因此開發(fā)和利用水溶性酵母葡聚糖,具有廣闊的應(yīng)用前景和市場開發(fā)潛力。1 酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)啤酒酵母細(xì)胞壁占細(xì)胞干重的20%30%,酵母細(xì)胞壁由29%64%的B葡聚糖、31%的甘露聚糖、13%的蛋白質(zhì)、9%的脂類和1%2%幾丁質(zhì)組成3。葡聚糖是酵母細(xì)細(xì)胞壁最重要的

3、結(jié)構(gòu)成分之一,其主要包括堿溶性和堿不溶性兩種,其中以堿不溶性B-1,3-葡聚糖占絕大多數(shù)。酵母堿不溶性B1,3-葡聚糖是一種活性多糖,制備酵母B-葡聚糖即提取堿不溶性B-1,3-葡聚糖。目前,其結(jié)構(gòu)研究得較為清楚,大部分是由D-葡萄糖通過B-1,3-鍵的方式相結(jié)合的聚合物,也有小部分以高度分支的B-1,6-鍵結(jié)合的葡聚糖4。B-1,3-葡聚糖生物活性主要由連接方式、分子大小和構(gòu)象所決定,高分子的B-1,3-葡聚糖具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu),它通常以三股螺旋的構(gòu)象存在,這種三股螺旋結(jié)構(gòu)對其免疫調(diào)節(jié)活性起至關(guān)重要的作用。酵母細(xì)胞壁中堿不溶性多糖80%以上是B-1,3-D-葡聚糖,其分子質(zhì)量大約為240 k

4、u,具有很強(qiáng)的免疫活性5。2 酵母葡聚糖的提取目前國內(nèi)外提取酵母B-1,3-D-葡聚糖的方法主要有酸法、堿法和酸堿綜合法等。2.1 酸法提取酸法提取是最早采用的酵母B-1,3-葡聚糖提取方法。一般用不同濃度的醋酸在50e90e溫度條件下處理3 h6 h,離心后沉淀脫水,干燥即得成品。早期國內(nèi)外學(xué)者對此法進(jìn)行了較多的研究,黃丹等6、黃剛良7對此提取方法進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,此法雖然產(chǎn)品得率高,但純度低,產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和甘露聚糖含量高,需要進(jìn)一步純化。由于這些原因使其應(yīng)用受到一定程度的限制,近年來國外對此提取方法的報(bào)道很少。但若對成品B-1,3-葡聚糖的純度要求不高,如作為飼料添加劑使用,其不失為一

5、種經(jīng)濟(jì)有效的提取方法8。2.2 堿法提取李衛(wèi)旗等9用堿法提取酵母B-1,3-葡聚糖。用不同濃度的NaOH高溫處理3 h6 h,離心后沉淀脫水,干燥即得成品。廖鮮艷等10對此法進(jìn)行了改進(jìn),采用二步堿處理方法進(jìn)行提取,降低了堿處理時(shí)NaOH溶液濃度,并提高了產(chǎn)品的純度。萬婕等11進(jìn)一步改進(jìn)提取工藝,在堿處理后離心,沉淀用蒸餾水懸浮,再用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5,離心、水洗、脫水、干燥。由于采用了酸性溶液洗滌,除去了部分酸溶性的糖元及B-1,6-D-葡聚糖,因而純度又有所提高。堿法提取所得的產(chǎn)品得率稍低,純度較高,但產(chǎn)品中還含有少量酸溶性糖元及B-1,6-D-葡聚糖。此法較適于對提取物純度要求較高的產(chǎn)品

6、,如食品和醫(yī)藥用品。2.3 酶-堿法Freimund S等12采用堿性Savinase蛋白酶來處理酵母細(xì)胞壁制備酵母葡聚糖,得到含量85%以上的葡聚糖樣品。馬森等13利用木瓜蛋白酶-堿法,得到了純度為90.50%,得率為11%的酵母葡聚糖。酶處理酵母細(xì)胞壁后能去除大量蛋白,從而降低后續(xù)堿的濃度和使用量,使得到的酵母葡聚糖產(chǎn)品分子結(jié)構(gòu)更加完整。由于葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)與其生物活性密切相關(guān),因此,酶法更適合于大規(guī)模酵母葡聚糖的提取純化。2.4 其他方法除上述傳統(tǒng)的方法外,一些研究學(xué)者還采用其他方法來制備純度較高的酵母葡聚糖產(chǎn)品。日本Ohno N等14采用次氯酸鈉溶液在室溫條件下處理酵母細(xì)胞壁得到的高純

7、度酵母葡聚糖產(chǎn)品,收率為20%。此方法雖能得到純度較高的酵母葡聚糖,但是強(qiáng)氧化劑對葡聚糖分子結(jié)構(gòu)的影響還有待深入研究,需考察對其生理活性的影響。以上方法獲得的B-1,3-葡聚糖呈中性,不帶電荷,由于其分子內(nèi)多羥基的相互作用,形成了致密的三股螺旋結(jié)構(gòu),導(dǎo)致B-1,3-葡聚糖不溶于水,只能作為飼料添加劑通過口服途徑來加以利用。當(dāng)動(dòng)物采食含有酵母葡聚糖的飼料后,其特異性和非特異性免疫功能都得到了增強(qiáng)。但口服途徑中會(huì)造成一定的浪費(fèi),酵母葡聚糖中的有效成分也會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)被消化系統(tǒng)消化掉一部分。許第新等15將從酵母細(xì)胞壁中獲得酵母葡聚糖以腹腔注射方法,用于增強(qiáng)克氏原螯蝦的免疫功能,取得了良好的效果。但該方

8、法在安全性方面令人擔(dān)憂。當(dāng)腹腔內(nèi)注射酵母葡聚糖時(shí),不溶或可溶性很差的B-葡聚糖直接注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)后,可能導(dǎo)致排斥反應(yīng),如發(fā)炎、疼痛、微栓塞、形成肉芽腫等限制了它作為藥物的應(yīng)用。如果能提高酵母葡聚糖的純度和水溶性,通過注射等手段應(yīng)用于人和動(dòng)物,來提高其免疫力,對實(shí)際應(yīng)用更有意義。因此,研究開發(fā)水溶性酵母葡聚糖,具有很好的應(yīng)用前景和市場開發(fā)潛力。3 酵母葡聚糖的結(jié)構(gòu)修飾及鑒定方法酵母葡聚糖的結(jié)構(gòu)修飾是提高葡聚糖水溶性的一種方法。目前提高葡聚糖水溶性的主要有方法有:物理修飾法,生物修飾法和化學(xué)修飾法。3.1 物理修飾法超聲波法物理修飾法主要是在不破壞酵母細(xì)胞壁多糖基本分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用外力方式將

9、其主鏈打斷,使其變?yōu)榭扇苄缘男》肿?以增加其溶解性。目前主要使用超聲波解聚的方法對酵母葡聚糖進(jìn)行修飾改性16。張開誠17對酸堿法、酶-酸堿法、超聲法進(jìn)行了對比提取試驗(yàn),結(jié)果表明,超聲波法提取葡聚糖工藝簡便,成本低廉,收率較高,提取后的廢液不含酸堿,對環(huán)境的污染較酸堿法要小,是一種非常有前途的提取葡聚糖的有效方法。3.2 生物修飾法酶法酶法水解酵母葡聚糖是通過B-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶來降低其聚合度,從而得到水溶性葡聚糖。B-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶能將B-1,3-葡聚糖水解為低聚糖、寡糖或還原糖。采用B-1,3-葡聚糖酶法增溶,不僅可通過控制水解度獲得一定分子質(zhì)量的水溶性的B-1,3-葡聚糖,而且可

10、避免使用化學(xué)方法帶來的污染及安全等問題,因此日益受到重視。Kery V等18研究表明,酶法得率較低。段會(huì)軻等19利用木霉菌株所產(chǎn)的B-1,3-葡聚糖酶對酵母B-1,3-葡聚糖進(jìn)行酶解增溶,得率達(dá)到52%。盡管酶的專一性和活性會(huì)對分子質(zhì)量產(chǎn)生很大影響,其仍具有較好的應(yīng)用前景。3.3 化學(xué)修飾法酵母葡聚糖的化學(xué)修飾已大有進(jìn)展,利用化學(xué)方法對糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團(tuán)進(jìn)行衍生化,如硫酸化、羧甲基化、磷酸化和乙?；葋硖岣叨嗵堑乃苄院突钚浴Ｄ壳把芯勘容^深入的有硫酸化和羧甲基化。3.3.1 硫酸化改性酵母葡聚糖硫酸酯是酵母葡聚糖糖大分子鏈中單糖分子上的羥基被硫酸根取代而形成的一類天然、半合成酸性

11、多糖。Williams DL等20利用均相磺化反應(yīng)體系制備水溶性葡聚糖。由于是均相反應(yīng)體系,產(chǎn)物和底物不好分離、產(chǎn)物雜質(zhì)高。黃國宏21將葡聚糖分散在二甲基甲酰胺中,以氯磺酸為酯化劑制備出取代度高達(dá)0.88的酵母葡聚糖硫酸酯。這種方法的取代度較高,但氯磺酸等為危險(xiǎn)試劑,不易操作。Wang Y J等22采用非均相反應(yīng)體系制備水溶性的B-1,3-葡聚糖硫酸酯。非均相反應(yīng)體系很好地克服了均相體系的缺陷,提高了產(chǎn)物純度,產(chǎn)物分離容易,且硫酸正丙醇反應(yīng)液可重復(fù)使用,減輕了環(huán)境污染。3.3.2 羧甲基化目前常用的羧甲基化方法是將129王成龍等:水溶性酵母葡聚糖的制備及應(yīng)用研究進(jìn)展葡聚糖溶于NaOH溶液中堿化

12、,再加異丙醇、氯乙酸,獲得羧甲基化衍生物。Sandula J等23采用氯乙酸作為底物,與葡聚糖在丙醇中反應(yīng),得到了不同取代度的羧甲基葡聚糖。楊文鴿等24以ClCH2-COOH為羧甲基化試劑,獲得了取代度為0.925的水溶性葡聚糖。王慶華等25以異丙醇為分散劑、氯乙酸鈉為醚化劑,采用二次加堿醚化反應(yīng),制備了取代度為0.55羧甲基葡聚糖。羧甲基葡聚糖的濃溶液屬假塑性流體,其流變性質(zhì)受電解質(zhì)、溫度和pH的影響,升高溫度或加入電解質(zhì)均使其黏度下降,中性pH的羧甲基葡聚糖的溶液的黏度最大26。3.4 酵母葡聚糖衍生物的鑒定方法酵母葡聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,經(jīng)修飾后更加復(fù)雜,僅用傳統(tǒng)的化學(xué)方法完全解析多糖結(jié)構(gòu)是十分

13、困難的,在修飾多糖結(jié)構(gòu)解析中常用紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜等方法分析多糖取代基的取代情況。3.4.1 紫外光譜法主要根據(jù)掃描的紫外光譜在206 nm處有無吸收峰來判斷是否含有酵母葡聚糖。酵母葡聚糖硫酸酯的紫外掃描圖在218、264、268、286nm處有S=O和-SO3的吸收,有別于一般的中性多糖,可用來鑒定葡聚糖硫酸酯27。但是,僅靠紫外光譜還不能完全確定,必須結(jié)合其他方法來聯(lián)合驗(yàn)證。3.4.2 紅外光譜法多糖結(jié)構(gòu)解析中主要采用中紅外光譜。應(yīng)用此法可以用來鑒定分子修飾的酵母葡聚糖糖。硫酸酯化葡聚糖鏈上主要取代基的特征譜為分子間、內(nèi)氫鍵使糖羥基在3 600 cm-13 200 cm

14、-1處出現(xiàn)一寬峰。根據(jù)紅外光譜圖是否具有800 cm-1860 cm-1處糖環(huán)C-O-S伸縮振動(dòng)的特征吸收峰以及1240 cm-1附近-O-SO3的S=O伸縮振動(dòng)吸收峰,即可定性判斷酵母葡聚糖殘基是否連接上了硫酸基團(tuán)及硫酸基團(tuán)的取代位置(800 cm-1950 cm-1。羧甲基葡聚糖如在波數(shù)1 600 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)的-COO-離子特征吸收峰, 1 423 cm-1出現(xiàn)與羧基相連的次甲基吸收峰,即表明其為羧甲基葡聚糖24。4 酵母葡聚糖的應(yīng)用4.1 酵母葡聚糖在水產(chǎn)動(dòng)物方面的應(yīng)用酵母葡聚糖可加快魚、蝦等水產(chǎn)動(dòng)物的免疫器官發(fā)育,增加淋巴細(xì)胞數(shù)量,增強(qiáng)體液免疫,對水產(chǎn)動(dòng)物具有較好的防病、治病作

15、用。Robertsen B等28試驗(yàn)表明,酵母菌聚糖能增強(qiáng)大西洋鮭對滅鮭氣單胞菌、鰻弧菌和魯克耶爾森菌抗感染能力。研究表明,酵母葡聚糖可提高鯽魚血清總蛋白的含量, 并且其血清凝集抗體效價(jià)、溶菌酶的活性、白細(xì)胞的吞噬指數(shù)均顯著高于空白對照組29。4.2 酵母葡聚糖在家禽方面的應(yīng)用酵母葡聚糖主要通過激發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答,維持動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡等來增強(qiáng)動(dòng)物免疫力,改善動(dòng)物健康狀況,增加其抗應(yīng)激能力,從而提高生產(chǎn)性能,增加經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí),它能順利通過動(dòng)物胃腸道而不被消化的特點(diǎn)也保證了其作用的發(fā)揮。李志清等30研究指出,肉仔雞日糧中添加葡聚糖能顯著提高0日齡49日齡雞的日增量和飼料轉(zhuǎn)化率。劉影等31

16、研究表明,純化酵母葡聚糖作為1周齡的雛雞的飼料添加劑,可顯著對抗侵入雛雞內(nèi)臟器官的腸炎沙門菌。4.3 酵母葡聚糖在家畜方面的應(yīng)用由于酵母葡聚糖提取物難溶于水,所以主要作為飼料添加劑在家畜飼料中應(yīng)用。潘樹德等32在免疫接種豬瘟疫苗的斷奶仔豬日糧中添加B-葡聚糖,結(jié)果表明,其可明顯提高斷奶仔豬的豬瘟抗體水平。王忠等33在斷奶仔豬日糧中添加B-1,3/1,6-葡聚糖可調(diào)節(jié)其脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,從而顯著提高其生長性能。5 展望啤酒加工的廢棄產(chǎn)物是酵母葡聚糖的主要來源,而我國是啤酒生產(chǎn)大國,每年廢棄的啤酒酵母有 4 萬噸左右。如果我們能將這些廢棄物變廢為寶, 這將產(chǎn)生很大的社會(huì)效益和

17、經(jīng)濟(jì)效益。目前,關(guān)于 酵母葡聚糖的提取還存在很多問題,主要表現(xiàn)在純 度低,產(chǎn)率低,不溶于水和提取方法繁瑣等方面;而 且關(guān)于酵母葡聚糖的提取和改性的方法一直處于研 究探索階段。以后的工作和研究重點(diǎn)將在以下幾方 面:¹選擇和優(yōu)化最佳的酵母葡聚糖提取方法,主要 選擇和優(yōu)化易操作、無污染、產(chǎn)量高的提取方法。 º 進(jìn)一步研究葡聚糖改性的方法來提高葡聚糖的水 溶性。»探討提高水溶性葡聚糖的純度和產(chǎn)率的方 法。¼研究水溶性葡聚糖衍生物的生物活性。½研 究水溶性葡聚糖作為免疫增強(qiáng)劑通過注射途徑應(yīng)用 于動(dòng)物,對其免疫功能的影響及作用。目前我國釀 酒酵母的廢物利用

18、已初見成效,相信不久將有更多 的啤酒酵母被開發(fā)利用,將會(huì)帶來更好的社會(huì)效益 和經(jīng)濟(jì)效益。 參考文獻(xiàn): 1 董小英,唐勝球.酵母多糖在動(dòng)物營養(yǎng)中的研究與應(yīng)用J.飼 料工業(yè),2005(2:14-17. 2 Suzuki K H,Tanaka H K.Effect of orally administered beta. 130 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2010 年 第 31 卷 第 12 期(總第 210 期glucan in macrophage function in miceJ.Immunopharmacology,1990,12:675-684. 3 Silke C J,Rohnb S,Lother

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