定量與常規(guī)PCR的差別ppt課件

1、常規(guī)常規(guī)PCRPCR技術(shù)：技術(shù)：對(duì)對(duì)PCRPCR擴(kuò)增反響的終產(chǎn)物進(jìn)展定量擴(kuò)增反響的終產(chǎn)物進(jìn)展定量及定性分析及定性分析定量定量PCRPCR技術(shù)：技術(shù)：通過(guò)對(duì)通過(guò)對(duì)PCRPCR擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析對(duì)起始模板定量及定性的分析三個(gè)關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)，定量，熒光三個(gè)關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)，定量，熒光Opticon實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之儀之 q初始初始 DNA DNA量越多量越多, , 熒光熒光到達(dá)某一值域值時(shí)到達(dá)某一值域值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少所需要的循環(huán)數(shù)越少qLogLog濃度與循環(huán)數(shù)呈線濃度與循環(huán)數(shù)呈

2、線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增到達(dá)域值的循環(huán)數(shù)就可到達(dá)域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模計(jì)算出樣品中所含的模板量板量確定初始模板的濃度確定初始模板的濃度R1R2RQqSYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位的小溝部位qSYBR Green 1 染料只要和雙鏈染料只要和雙鏈DNA結(jié)合后才結(jié)合后才發(fā)熒光。發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT變性 DNA未結(jié)合SYBR Green 1 dyeq起始模板濃度定量q融解曲線分析 q-可

3、區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和或引物二聚體q基因型分析q使用方便q - 不用設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物 q沒(méi)有序列特異性q - 可以用于不同的模板 q廉價(jià) q靈敏q與非特異性產(chǎn)物結(jié)合與非特異性產(chǎn)物結(jié)合發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜交探針原理：熒光諧振能量傳送原理：熒光諧振能量傳送FRETFRET 莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目的序列完全配對(duì)環(huán)與目的序列完全配對(duì)莖莖熒光素?zé)晒馑卮銣鐒┐銣鐒┉h(huán)環(huán)TACCGGGGGTTACGAACGGTAATTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTACCGGGGGTTACGAACG GTAATTTTTGCCCCCAAAAQ熒光素目的序列莖淬滅劑q定量起始

4、模板濃度定量起始模板濃度q基因型分析基因型分析q鑒定產(chǎn)物鑒定產(chǎn)物q單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性SNP檢測(cè)檢測(cè)q對(duì)目的序列有很高的特異性對(duì)目的序列有很高的特異性q 用于用于SNPSNP檢測(cè)的最靈敏的試劑之一檢測(cè)的最靈敏的試劑之一q熒光背景低熒光背景低q設(shè)計(jì)困難設(shè)計(jì)困難q無(wú)終點(diǎn)分析功能無(wú)終點(diǎn)分析功能q只能用于一個(gè)特定的目的只能用于一個(gè)特定的目的q價(jià)格較高價(jià)格較高探針探針熒光素?zé)晒馑卮銣鐒┐銣鐒┧庑碗s交探針?biāo)庑碗s交探針q目的特異性探針q5 為熒光素， 3 為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目的序列互補(bǔ)3355模板和探針雜交5533ForwardPrimerReversePrimerQR3355TACCGGGGGTTACGAACG GTAATG A T C C T A C CG A T C C C A C Cq定量起始模板濃度定量起始模板濃度q基因型分析基因型分析q產(chǎn)物鑒定產(chǎn)物鑒定qSNPSNP分析分析q對(duì)目的序列有很高的特異性q -特別合適于SNP檢測(cè)q與 Molecular Beacons 相比設(shè)計(jì)相q 對(duì)簡(jiǎn)單結(jié)合于雙鏈結(jié)合于雙鏈DNA的小溝的小溝中中發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜交探針?biāo)庑碗s交探針?biāo)庑碗s交探針5-3外切外切延伸延伸復(fù)性復(fù)性任何任何步驟步驟定量和檢測(cè)目的基因定量和檢測(cè)目的基因融解曲線分析融解曲線分析SNP分析分析定量和檢測(cè)目的基因定量和檢測(cè)目的基