蔬菜農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù)

1、蔬菜農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法概述蔬菜農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法概述目前農(nóng)藥在蔬菜中的殘留問(wèn)題目前農(nóng)藥在蔬菜中的殘留問(wèn)題l農(nóng)藥是把“雙刃劍”，對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)有極其重要的作用。但由于農(nóng)藥本身固有的化學(xué)屬性和對(duì)其使用不當(dāng)，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)，嚴(yán)重危害到廣大人民群眾的身體健康。l在我國(guó)農(nóng)藥中，70為有機(jī)磷農(nóng)藥，而在我國(guó)生產(chǎn)使用的有機(jī)磷農(nóng)藥中，70為劇毒、高毒類(lèi)，而且較多是禁止在蔬菜作物上使用的。農(nóng)藥中毒事件常有報(bào)道農(nóng)藥中毒事件常有報(bào)道 ，究其原因，究其原因 l1.農(nóng)產(chǎn)品不按規(guī)定的用藥量、次數(shù)、方法或安全間隔期施藥，或施用不允許在蔬菜上使用的劇毒、高毒農(nóng)藥；l2.現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)施行的農(nóng)藥殘留測(cè)定需要通過(guò)有機(jī)

2、溶劑提取、凈化和用大型分析儀器進(jìn)行，無(wú)法對(duì)廉價(jià)的蔬菜進(jìn)行隨時(shí)隨地或快速的檢測(cè)而形成的監(jiān)管不到位。 目前所使用的農(nóng)藥按其化學(xué)結(jié)構(gòu)大致可分目前所使用的農(nóng)藥按其化學(xué)結(jié)構(gòu)大致可分為以下幾類(lèi)：為以下幾類(lèi)： l有機(jī)氯類(lèi)；l有機(jī)磷類(lèi)；l氨基甲酸酯類(lèi)；l擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)等。 l根據(jù)以上情況，制定出有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的快速檢測(cè)方法，加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)已成為十分必要的監(jiān)管措施。農(nóng)藥殘留主要的檢測(cè)方法有兩種：農(nóng)藥殘留主要的檢測(cè)方法有兩種：色譜檢測(cè)法 色譜檢測(cè)法用作農(nóng)殘定量分析，可為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供依據(jù)。 速測(cè)儀法 速測(cè)儀法只能作農(nóng)殘定性分析，對(duì)于檢測(cè)人員技術(shù)水平要求低，易于在基層推廣等特點(diǎn)，是目前我國(guó)控制高

3、毒農(nóng)藥殘留的一種有效方法，也是目前國(guó)內(nèi)和我省應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法。速測(cè)儀法的主要優(yōu)點(diǎn)：速測(cè)儀法的主要優(yōu)點(diǎn)：l1. 該方法具有快速方便、前處理簡(jiǎn)單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)定性測(cè)定，特別適合在蔬菜生產(chǎn)基地、批發(fā)市場(chǎng)及農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)部門(mén)開(kāi)展快速檢測(cè)工作。l2. 該方法可對(duì)有農(nóng)藥殘留的蔬菜進(jìn)行粗篩，將一部分農(nóng)藥殘留含量較高的蔬菜控制在市場(chǎng)之外，避免因農(nóng)藥殘留發(fā)生中毒事件。速測(cè)儀法的主要缺點(diǎn)速測(cè)儀法的主要缺點(diǎn):l1. 酶試劑易失活，導(dǎo)致反應(yīng)不穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果誤差較大，重復(fù)性不好， 實(shí)際應(yīng)用中的確認(rèn)率大約為 60%70%左右；l2. 存在檢測(cè)盲區(qū)，只能檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯兩類(lèi)農(nóng)藥，不能檢測(cè)有

4、機(jī)氯類(lèi)、菊酯和其它類(lèi)別的劇毒農(nóng)藥； l3. 不適合檢測(cè)蔥蒜類(lèi)、香菜、韭菜、番茄、胡蘿卜、茭白、蘑菇、花椒等 14 種容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的農(nóng)產(chǎn)品；速測(cè)儀的檢測(cè)方法有兩種速測(cè)儀的檢測(cè)方法有兩種:(GB/T5009.199-2003)速測(cè)卡法（紙片法）酶抑制率法（分光光度法） 兩種快速檢測(cè)方法的技術(shù)原理l根據(jù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥能抑制昆蟲(chóng)中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶的活性造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的積累，影響正常傳導(dǎo)，導(dǎo)致昆蟲(chóng)中毒致死的原理而設(shè)計(jì)。l如果蔬菜中不含有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，乙酰膽堿酯酶水解后，水解產(chǎn)物可與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。兩種快速檢測(cè)方法的技術(shù)原理l如果蔬菜中含可以抑制乙酰膽堿

5、酯酶的活性的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，這種酶就不能被水解，從而無(wú)顯色反應(yīng)。l在溶液中加入乙酰膽堿酯酶和顯色劑，用此判斷有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留是否存在。速測(cè)卡法（紙片法）速測(cè)卡法（紙片法）l1.試劑試劑 l1.1 固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片(速測(cè)卡)。l1.2 pH7.5緩沖溶液：分別取15.0g磷酸氫二鈉(Na2HP0412H2O)與1.59g無(wú)水磷酸二氫鉀KH2P04，用500mL蒸餾水溶解。l2儀器儀器l2.1常量天平 有條件時(shí)配備372恒溫裝置速測(cè)卡法（紙片法）速測(cè)卡法（紙片法）l3.分析步驟分析步驟l3.1整體測(cè)定法整體測(cè)定法l3.1.1選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面

6、泥土，剪成選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見(jiàn)方碎片，取左右見(jiàn)方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液，震搖緩沖溶液，震搖50次，靜置次，靜置2min以上。以上。l3.1.2取一片速測(cè)卡，用白色藥片沾取提取液，放置取一片速測(cè)卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37恒溫裝置中恒溫裝置中放置放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。 速測(cè)卡法（紙片法）速測(cè)卡法（紙片法）l3.1.3將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)

7、。l3.1.4每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照卡。 速測(cè)卡法（紙片法）速測(cè)卡法（紙片法） l3.2表面測(cè)定法（粗篩法表面測(cè)定法（粗篩法）l3.2.1擦去蔬菜表面泥土，滴23滴緩沖溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。l3.2.2取一片速測(cè)卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。速測(cè)卡法（紙片法）速測(cè)卡法（紙片法）l3.2.3放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37 恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。l3.2.4將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)。l3.2.5每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照卡。結(jié)果判定結(jié)果判定l 陽(yáng)性

8、結(jié)果陰性結(jié)果白色 藍(lán)色 結(jié)果判定結(jié)果判定l結(jié)果以酶被有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥抑制(為陽(yáng)性)、未抑制（為陰性）表示。l與空白對(duì)照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽(yáng)性結(jié)果。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對(duì)照卡相同，為陰性結(jié)果。l對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的樣品，可用其它分析方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。速測(cè)卡法（紙片法）注意事項(xiàng)速測(cè)卡法（紙片法）注意事項(xiàng)l1.有些蔬菜如生姜、蔥、蒜、辣椒和番茄等的汁液中含有破壞酶 活性或者使藍(lán)色產(chǎn)物褪色的物質(zhì)， 處理這類(lèi)蔬菜時(shí)，不要讓其汁液太多釋放出來(lái)，不要剪得太碎，浸提時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，必要時(shí)可采用整枝蔬菜浸提或采用表面測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株(

9、體)蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。速測(cè)卡法（紙片法）注意事項(xiàng)速測(cè)卡法（紙片法）注意事項(xiàng)l2.試紙上的提取液不可太多而溢出試紙，亦不可太少而使反應(yīng)不完全。 l3.最好將每一批樣品處理好后一起加樣，以免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)蒸干。 速測(cè)卡法（紙片法）注意事項(xiàng)速測(cè)卡法（紙片法）注意事項(xiàng)l4.當(dāng)溫度條件低于37，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)，延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以空白對(duì)照卡用（體溫）手指捏3分鐘時(shí)可以變藍(lán)，即可往下操作。注意樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照卡放置的時(shí)間一致才有可比性。l5.空白對(duì)照卡不變色的原因：一是藥片表面緩沖溶液加的少，預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤(rùn)，二是溫度太低。速測(cè)卡法（紙

10、片法）注意事項(xiàng)速測(cè)卡法（紙片法）注意事項(xiàng)l6.如有條件，將農(nóng)藥速測(cè)卡放在 10以下保存效果會(huì)更好，每小包產(chǎn)品開(kāi)封后最好在 三天內(nèi)用完，如用不完，可放入將有變色硅膠吸潮劑的瓶中密封保存，如發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥速測(cè)卡的紅色 藥片由鮮紅橙色變?yōu)榘档暮旨t色，說(shuō)明紙片已吸潮失效。 PR-3 便攜式農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀便攜式農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀 l操作步驟 l1.接通電源，右側(cè)開(kāi)關(guān)撥至“開(kāi)”，打開(kāi)上蓋按“START”鍵預(yù)熱；l2.當(dāng)預(yù)熱達(dá)到設(shè)置反應(yīng)溫度TEMP時(shí)，聽(tīng)到“嘩”一聲，屏幕顯示“TEMP1”，預(yù)熱結(jié)束，等待倒計(jì)時(shí)；l3.去試紙外膜，插入試紙（白片在下端），在白片上分別加1-2滴提取液；PR-3 便攜式農(nóng)藥殘毒

11、快速檢測(cè)儀便攜式農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀 l4.再次按“START”鍵，單片電腦開(kāi)始“TEMP1”倒計(jì)時(shí)；l5.當(dāng)聽(tīng)到連續(xù)“嘩、嘩、嘩”聲，屏幕顯示“CLOS”，提示合上前蓋，進(jìn)入“TEMP2”倒計(jì)時(shí)；l6.當(dāng)聽(tīng)到六聲“嘩、嘩、嘩”音，本次操作結(jié)束，打開(kāi)上蓋觀察試紙顏色變化；l7.試紙顯示藍(lán)色為陰性，淺藍(lán)色為弱陽(yáng)性，白色為陽(yáng)性；l8.測(cè)試完畢，向上取下試紙進(jìn)行下一次的檢測(cè)。 酶抑制率法（分光光度法）酶抑制率法（分光光度法）l1.試劑試劑l1.1 pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無(wú)水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000ml蒸餾水溶解。l1.2 顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DT

12、NB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20ml緩沖溶液溶解，4冰箱中保存。酶抑制率法（分光光度法）酶抑制率法（分光光度法） l1.3 底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0ml蒸餾水溶解，搖勻后置4 冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過(guò)兩周。l1.4 乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min的吸光度變化Ao值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后置4冰箱中保存?zhèn)溆?，保存期不超過(guò)四天。酶抑制率法（分光光度法）酶抑制率法（分光光度法）l1.5 可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的Ao值應(yīng)控制在0.3以上。l2.儀器儀器l2.1 分光光度計(jì)或相應(yīng)測(cè)定儀及常量天平。酶抑制率法（分光光度法）酶抑制率法

13、（分光光度法）l3.分析步驟分析步驟l3.1 樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成洗掉表面泥土，剪成1cm左右見(jiàn)方碎片，取樣左右見(jiàn)方碎片，取樣品品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖緩沖溶液，振蕩溶液，振蕩12min，倒出提取液，靜置，倒出提取液，靜置35min，待用。，待用。酶抑制率法（分光光度法）酶抑制率法（分光光度法）l3.2 對(duì)照溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37放置15min以上(每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致)。加入0.1mL底物搖勻，此時(shí)檢液

14、開(kāi)始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值A(chǔ)o。酶抑制率法（分光光度法）酶抑制率法（分光光度法）l3.3 樣品溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值A(chǔ)t。結(jié)果的表述計(jì)算結(jié)果的表述計(jì)算l檢測(cè)結(jié)果按公式計(jì)算：l抑制率()=(Ao-At)Ao100l式中：Ao-對(duì)照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；lAt-樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；結(jié)果判定結(jié)果判定l結(jié)果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率50時(shí)，表示蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥存在，樣品為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果的樣品需要

15、重復(fù)檢驗(yàn)2次以上。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的樣品，可用其它方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。酶抑制率法注意事項(xiàng)酶抑制率法注意事項(xiàng)l1. 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。處理這類(lèi)樣品時(shí)，可采取整株(體)蔬菜浸提。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株(體)蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。酶抑制率法注意事項(xiàng)酶抑制率法注意事項(xiàng)l2.當(dāng)溫度條件低于37，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)，延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對(duì)照測(cè)試3min的吸光度變化Ao值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照溶液放置

16、時(shí)間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對(duì)照溶液3min的吸光度變化Ao值0.3的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。酶抑制率法注意事項(xiàng)酶抑制率法注意事項(xiàng)l3.當(dāng)吸光度大到無(wú)法讀取時(shí)，說(shuō)明測(cè)定液渾濁有干擾。 l4.待測(cè)樣品放入分光光度計(jì)速度的影響。待測(cè)樣品加入底物后，應(yīng)馬上搖勻，放入測(cè)定儀，否則影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。酶抑制率法注意事項(xiàng)酶抑制率法注意事項(xiàng)l5.比色杯的透光度影響。保持比色杯的清潔，使比色杯有好的透光度是減少檢測(cè)誤差的必要條件。比色杯可定期用乙醇進(jìn)行清洗。l6.微量移液器的影響。微量移液器要專(zhuān)用，貼上標(biāo)簽，避免交叉使用造成試劑污染；試劑從試劑瓶吸出后，不能再放回瓶中，堅(jiān)持只吸不進(jìn)的原則，防止試

17、劑污染。酶抑制率法注意事項(xiàng)酶抑制率法注意事項(xiàng)l7.藥品配制過(guò)程中的影響。磷酸鹽緩沖液的配置一定要用蒸餾水、純凈水或去離子水，不可使用礦物質(zhì)水，否則在測(cè)量過(guò)程中干擾較大，影響準(zhǔn)確性。信儀科技信儀科技PR-203-6T農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀 l1.試劑制備l1.1緩沖液：將緩沖液試劑袋中的試劑倒入燒杯，溶于500ml蒸餾水中，溶解，混勻即可。室溫保存。l1.2 酶試劑：目前提供的酶試劑已配成溶液可直接使用。0-5環(huán)境下保存。信儀科技信儀科技PR-203-6T農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀l1.3 顯色劑：向標(biāo)有“顯色劑”的試劑瓶中用可調(diào)定量移液器加入25ml緩沖液，溶解、混勻即

18、可。室溫保存。l1.4 底物：向標(biāo)有“底物”的試劑瓶中用可調(diào)定量移液器加入2.5ml蒸餾水，溶解、混勻即可。0-5環(huán)境下保存。信儀科技信儀科技PR-203-6T農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀l2. 儀器測(cè)試操作步驟：l2.1 待測(cè)試液的制備：用天平稱(chēng)取2g有代表性的果蔬樣品（葉菜剪成1厘米左右見(jiàn)方的菜樣，塊根菜取1厘米見(jiàn)方表皮樣品）放入三角瓶中，加入10ml緩沖液，用手振蕩提取2分鐘后用濾紙干濾，取出清液即為待測(cè)液。信儀科技信儀科技PR-203-6T農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀l2.2 對(duì)照溶液的測(cè)試：在1cm比色皿中，加入酶100l，加入緩沖液2.5mL，用保鮮膜蓋住比色皿口，

19、用右手大拇指按住保鮮膜，食指托住比色皿的底部，拿起搖勻，再加入顯色劑100l,加入底物20l，同樣用保鮮膜蓋住比色皿口，拿起搖勻，儀器強(qiáng)制歸“100%”后立即放入儀器第一通道中，按下“對(duì)照”鍵進(jìn)行測(cè)試。信儀科技信儀科技PR-203-6T農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀l2.3 樣品溶液的測(cè)試：在比色皿中，加入酶100l，加入待測(cè)試液2.5mL，搖勻，靜置10分鐘后，加入顯色劑100l，加入底物20l，搖勻，儀器強(qiáng)制歸“100%”后立即放入儀器比色皿池中，按下“樣品”鍵進(jìn)行測(cè)試。信儀科技信儀科技PR-203-6T農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀l2.4 測(cè)試結(jié)果的判讀：樣品的抑制率在40%-50%之間為可疑農(nóng)殘超標(biāo)樣品，抑制率大于50%為農(nóng)殘超標(biāo)樣品，抑制率40%的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2次以上，如有必要時(shí)，可用氣相色譜等方法作進(jìn)一步確認(rèn)。臺(tái)灣農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀（臺(tái)灣農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)儀（96孔）孔）檢測(cè)試劑的調(diào)配：檢測(cè)試劑的調(diào)配：l1