流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能的方法建立

1、流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能的方法建立    【摘要】 目的：建立用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹腔誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬功能的方法。方法：用貼壁法篩選有活性的巨噬細(xì)胞，再與用碳酸鹽緩沖液制備的熒光素(FITC)標(biāo)記的大腸埃希菌混合，37孵育，每10min取少量固定后加EB染巨噬細(xì)胞核，用流式細(xì)胞儀檢測，計算巨噬細(xì)胞對大腸埃希菌的吞噬率。結(jié)果：FITC能夠有效標(biāo)記大腸埃希菌；小鼠腹腔誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞能夠吞噬大腸埃希菌，并且在30min時達(dá)到最大峰值。結(jié)論：用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠巨噬細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記大腸埃希菌是測定巨噬細(xì)胞吞噬功能簡便、快速和重復(fù)性好的定量方法。

2、60;   【關(guān)鍵詞】 巨噬細(xì)胞 吞噬作用 大腸埃希菌 流式細(xì)胞儀 Establish a New Method of Detecting Phagocytosis of Macrophage by Flow Cytometry Abstract Objective: To use a new method of detecting phagocytosis of macrophage induced from the Belly of mouse by flow cytometry. Methods: Firstly, the living macrophage

3、s were collect by cultivating and adherencing, and bacterium coli(E. coli) was labeled FITC. Secondly, E. coli was mixed with macrophages, every 10 minute to take out of small amounts of mixed liquor,and add a little of EB dye. Finally, the fluorescent intensity was measured by flow cytometry. Resul

4、ts: The E. coli was labeled well by FITC in carbonate buffer. Macrophage can phagocytize E. coli and the efficient rat of phagocytosis was highest about at 30 minute. Conclusion: The method that detecting phagocytosis of macrophage phagocytizs E. coli is convenient、fast、good repeatability. 

5、0;  Key words macrophage; phagocytosis; bacterium coli; flow cytometry 巨噬細(xì)胞(macrophage，MP)是機體天然免疫的主要免疫細(xì)胞，吞噬率則直接反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能。通常測定吞噬率的方法是對吞噬細(xì)菌的MP染色后在顯微鏡下觀察、計數(shù)的方法，也有研究者用流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測MP的吞噬功能1,2。我們在檢測小鼠MP吞噬細(xì)菌的實驗中發(fā)現(xiàn)，小鼠MP的形態(tài)較小，染色后在顯微鏡下觀察計算吞噬率較為困難。本研究試建立用流式細(xì)胞術(shù)FITC?EB法檢測MP的吞噬功能，以求找到一種簡

6、便、客觀和重復(fù)性好的方法。 1 材料和方法 1.1 實驗材料 1.1.1 主要試劑 FITC；EB；2%淀粉肉湯；大腸埃希菌DH5A；2%瓊脂LB固體培養(yǎng)基；含血清培養(yǎng)基；流式細(xì)胞儀四色校準(zhǔn)微球(CaliBRITEBeads，美國BD公司)。 1.1.2 實驗動物    BALB/C小鼠，25只，體重(19±2)g,由本院免疫學(xué)教研室保存提供。 1.1.3 主要儀器和軟件    隔水恒溫培養(yǎng)箱，型號：GNP?9270 (上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；自控式CO2細(xì)胞孵育箱,型號：2300（美國Shellab

7、公司）；分光光度計，型號：Jenway 6305 (Barloworld公司)；蔡司熒光顯微鏡，型號：ZEISS AXIO Imager.A1 (蔡司光學(xué)儀器（上海）國際貿(mào)易有限公司)；流式細(xì)胞儀，型號：FACSCalibur (美國BD公司)；CellQuest軟件。 1.2 實驗方法 1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)及標(biāo)記熒光素(FITC)    接種大腸桿菌于2%瓊脂LB固體培養(yǎng)基表面皿上，在37隔水恒溫培養(yǎng)箱中孵育48h，取少量菌落用PBS洗，革蘭氏（圖1）和G?W染色觀察（圖3），并調(diào)節(jié)濃度(OD0.40在620nm處）。熒光素標(biāo)記大腸桿菌3：離心去上

8、清，加入250ul 1%Triton X?100 和1ml FITC（0.01mg FITC/500ul 碳酸鹽緩沖液）37避光孵育15min，離心去上清，少量PBS重懸細(xì)菌待用，并用熒光顯微鏡觀察（圖2）。 1.2.2 巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌    誘導(dǎo)、篩選腹腔巨噬細(xì)胞：腹股溝注入1ml2%淀粉肉湯液，48h后開腹腔收集滲出液，培養(yǎng)基洗一次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中37 CO2孵育箱孵育2h，收集貼壁細(xì)胞（1×107event）于離心管中4ml培養(yǎng)基重懸待用，并G?W染色觀察（圖3）。檢測巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌：加FITC標(biāo)記大腸桿菌于巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，置

9、于37水平搖床上（慢速搖動），每10min取搖勻液0.5ml，PBS洗一次，70%乙醇固定10min，離心后加入1ml EB(0.5g/ml)，37避光孵育15min待測。首先使用BD CaliBRITE Beads試劑調(diào)整儀器，設(shè)定儀器基本參數(shù)，上樣后先用FSC?H/SSC?H圈定MP，再采集紅色熒光強度，并計算實際吞噬率（某時刻實際吞噬率=某時刻吞噬率-0min時的吞噬率），同時取少量G?W染色觀察（圖3）。 1.3 統(tǒng)計分析    采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。  &#

10、160; 2 結(jié)果 2.1 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記大腸埃希菌的定量觀察    由大腸埃希菌的革蘭氏染色圖像（圖1）可以看出：大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，并沒有其他細(xì)菌污染，可以應(yīng)用于吞噬實驗；由大腸埃希菌的熒光顯微鏡觀察（圖2）可以看出：用碳酸鹽緩沖液(pH=9) 制備的熒光素(FITC)能夠有效標(biāo)記大腸埃希菌；在不同時間段G?W染色觀察巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌過程的圖像（圖3）中可以看出：在020min內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的量逐漸增加（巨噬細(xì)胞吞噬泡中大腸埃希菌的量增加），30min左右時巨噬細(xì)胞吞噬量最高，40min后巨噬細(xì)胞吞噬量有

11、減少趨勢（吞噬泡中有明顯的溶菌現(xiàn)象，泡內(nèi)大腸桿菌形態(tài)逐漸模糊）。 2.2 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記大腸埃希菌的動力學(xué)特點    小鼠巨噬細(xì)胞與FITC標(biāo)記大腸埃希菌在37作用不同時間后, 巨噬細(xì)胞的實際吞噬率在0、10、20、30、40、50min時分別為0%、11.20±2.0%、21.57±2.1%、62.22±5.0%、54.58±3.5%、37.22±4.1%，在30min左右即達(dá)到峰值（表1，圖4）。表1 巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的動力學(xué)數(shù)據(jù)(略) 3 討論   

12、 人類細(xì)胞免疫功能一般認(rèn)為應(yīng)包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等三大系統(tǒng)，其相應(yīng)的檢測指標(biāo)分別為：以CD4和CD8為主的T細(xì)胞亞群檢測，以RBC?C3bRR和RBC?ICR為主的紅細(xì)胞免疫功能檢測和以巨噬細(xì)胞吞噬率為主的巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測。但是，在臨床上由于細(xì)胞免疫功能檢測方法較繁瑣，往往作前兩項檢測，對于某些免疫性疾病以及與免疫功能損傷有關(guān)疾病的診斷與治療中，全面地評估機體的免疫狀態(tài)極為重要。    檢測MP功能最常用的方法之一就是檢測其對細(xì)菌的吞噬率，傳統(tǒng)方法是取外周血與細(xì)菌混合作用后涂片染色，在顯微鏡下觀察MP對細(xì)菌的吞噬率。該方法一般要尋找

13、200個以上MP中吞噬細(xì)菌MP數(shù)量，操作較煩瑣，且形態(tài)較小，顯微鏡下觀察其對細(xì)菌的吞噬率更為困難。因此，已有研究者報道用流式細(xì)胞術(shù)測定中性粒細(xì)胞對熒光素標(biāo)記細(xì)菌的吞噬功能4,5，但目前有關(guān)巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測報道不多。    本研究在前人研究基礎(chǔ)上6，選擇FITC和EB雙熒光性物質(zhì)標(biāo)記法檢測MP對大腸埃希菌的吞噬功能。其檢測原理是：首先利用FITC在碳酸鹽緩沖液中標(biāo)記大腸埃希菌，再用MP吞噬標(biāo)記后的大腸埃希菌，吞噬完成后，加入EB染料標(biāo)記MP，在488nm的激光下MP內(nèi)大腸埃希菌上的FITC首先發(fā)出綠色熒光，其熒光又可以激發(fā)MP上的EB染料，使其產(chǎn)生紅

14、色熒光，通過計算紅色熒光的表達(dá)率反映MP對大腸埃希菌的吞噬功能。實驗結(jié)果顯示：020min內(nèi)吞噬率逐漸增加；30min左右吞噬率達(dá)到平臺，與有關(guān)資料一致；40min以后吞噬率反而減少，有可能通過MP內(nèi)溶菌酶作用把MP內(nèi)細(xì)菌消化、分解，釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致MP內(nèi)細(xì)菌減少,熒光能力減弱。其中，在流式細(xì)胞儀熒光強度直方圖中CV平均值為3.9%，由此可見，自動流式細(xì)胞儀用于檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能，不但測量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡便、快速，而且保持MP細(xì)胞膜的完整性，能夠直接體現(xiàn)MP對細(xì)菌的吞噬能力，同時彌補了FITC熒光性弱難以區(qū)分、檢測的弱點。    本實驗

15、結(jié)果充分證明通過流式細(xì)胞術(shù)的FITC?EB法能夠簡便、快速和重復(fù)性好地定量檢測巨噬細(xì)胞對大腸埃希菌的吞噬功能。 【參考文獻(xiàn)】 1 張盈華,殷纓,張莉,等.流式細(xì)胞儀測定巨噬細(xì)胞吞噬率方法的建立及其應(yīng)用.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報.2002,23(17):15591561.2 White?Owen C,Alexander JW,Sramkoski RM,et al.Rapid whole blood microassay using flow cytometry for measuring neutrophil phagocytosis. J Clin Microbiol, 1992,30(8):20712076.3 趙修春,姚春艷,李柏青,等.流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠中性粒細(xì)胞吞噬功能的方法學(xué)探討.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué).2004,29(5):388390.4 Vander Top EA, Perry GA, Gentry?Nielsen MJ. A novel flow cytometric assay for measurement of in vivo pulmonary neutrophil phagocytosis. BMC Microbiology. 2006,6:61.5 L