分子生物學檢驗技術(shù)

1、1、分子生物學檢驗技術(shù)：是以核酸或蛋白質(zhì)為分析材料，通過分析基因的結(jié)構(gòu)、表達的變化和由此而導致的基因功能的改變，為疾病的研究和診斷提供更準確、更科學的信息和依據(jù)的一門學科。2、請說明分子生物學檢驗技術(shù)在臨床試驗診斷中的應(yīng)用。（1）感染性微生物的檢測。如：用PCR技術(shù)進行甲型肝炎病毒的檢測、乙型肝炎病毒的檢測和解脲脲原體的檢測等。（2）基因突變的檢測。如：用PCR一限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)技術(shù)檢測地中海貧血基因突變。（3）法醫(yī)學檢測。如：用PCR微衛(wèi)星檢測技術(shù)進行親子關(guān)系的鑒定和個體識別。（4）基因異常表達的檢測。如：用cDNA表達的芯片技術(shù)進行基因異常表達的檢測。（5）基因定位。如：用

2、原位雜交技術(shù)進行組織與細胞中基因表達的定位。3、基因組：是一個細胞或一種生物體的整套遺傳物質(zhì)。4、基因：是基因組中一個功能單位，是貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈信息或RNA序列信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列。5、原核生物：是細菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、放線菌和藍綠藻等原始生物的總稱，是最簡單的細胞生物體。6、操縱子結(jié)構(gòu)：是原核生物基因組的功能單位。7、質(zhì)粒：是指細菌細胞染色體外，能獨立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的共價閉合環(huán)狀分子。8、轉(zhuǎn)座因子：又稱為轉(zhuǎn)座元件，是一類在細菌染色體、質(zhì)粒和噬菌體之間自行移動并具有轉(zhuǎn)位特性的獨立的DNA序列。9、原核生物基因組的結(jié)構(gòu)特征：（1）原核生物基因組通常

3、僅由一個DNA分子構(gòu)成，基因組中只有一個復(fù)制起點，具有類核結(jié)構(gòu)。（2）具有操縱子結(jié)構(gòu)，模板mRNA為多順反子mRNA。編碼區(qū)遠遠大于真核生物基因組，但又遠遠小于病毒基因組。在基因組中存在多功能的識別區(qū)域，如復(fù)制起始區(qū)、轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)和終止區(qū)等，這些區(qū)域常常含有反向重復(fù)序列。（3）結(jié)構(gòu)基因通常為單拷貝基因，編碼順序一般不重疊。（4）具有編碼同工酶的基因。（5)含有可移動的DNA序列。10、病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點：（1）與細菌和真核生物基因組相比，病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單，基因數(shù)少，所含信息量也少。（2）病毒基因組的核酸類型較多，有雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA和單鏈RNA；有環(huán)狀分子，也有線性分子。但無

4、論是哪種核酸類型，一種病毒顆粒中核酸成分只能為一種，或DNA，或RNA。（3）基因組中有基因重疊現(xiàn)象，這種結(jié)構(gòu)的意義在于使較小的基因組能攜帶較多的遺傳信息。（4）基因組中具有操縱子結(jié)構(gòu)。（5）病毒基因可連續(xù)也可間斷。（6）基因組中重復(fù)序列少。（7）基因組中非編碼區(qū)少。（8）病毒基因組是單倍體。（9）病毒基因組核酸序列中功能相關(guān)的蛋白質(zhì)基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定部位，形成一個功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。（10）病毒基因組含有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因。11、真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點：（1)真核生物基本上不存在操縱子結(jié)構(gòu)，一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子，許多蛋白是由相同或不同的亞基

5、構(gòu)成，因此涉及多個基因的協(xié)調(diào)表達。（2）基因組中非編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域，并且，編碼蛋白質(zhì)的基因一般是不連續(xù)的斷裂基因，即有外顯子和內(nèi)含子，在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切成成熟mRNA后，才能翻譯成蛋白質(zhì)。（3）基因組DNA有重度、中度和低度三種重復(fù)序列。（4）基因組DNA具有多基因家族與假基因。（5）基因組DNA結(jié)構(gòu)存在不同程度的差異，即基因多態(tài)性。（6）基因組DNA也有基因重疊現(xiàn)象。（7）真核細胞的染色體末端存在一種由DNA片段和蛋白質(zhì)組成的獨特結(jié)構(gòu)，即端粒。它能維持染色體的穩(wěn)定性。12、乙型肝炎病毒（HBV）基因組的結(jié)構(gòu)：HBV基因組的長度為3.2kb，是帶有部分單鏈區(qū)的環(huán)狀雙鏈DNA分子，是目前已知感

6、染人類最小的DNA病毒。HBV的兩條鏈長度不等，長的鏈為負鏈，用“L（-）”表示，其長度是固定的，攜帶有病毒全部的編碼信息；短的為正鏈，用“S(+)”表示，正鏈在不同的分子中長度不等，一般長約1.6-2.8kb,大約是負鏈的50%-100%，并且短鏈的5端位置是固定的，而3端的位置是可變的。在負鏈的5端有一低分子量的蛋白質(zhì)，在正鏈的末端則有一段短RNA，它們是引導DNA合成的引物。兩條鏈的5端有約250-300bp可互補結(jié)合，所以也稱為黏性末端，這種互補結(jié)合是DNA保持雙鏈環(huán)狀的基礎(chǔ)。此外，這部分核苷酸序列也是HBV最常整合到肝細胞染色體DNA中得序列。在黏性末端的兩側(cè)還各有11個核苷酸構(gòu)成的

7、順向重復(fù)序列，分別稱為DR1和DR2，DR1在負鏈5端，DR2在正鏈5端，中間相隔223個核苷酸。DR區(qū)域是DNA成環(huán)及病毒復(fù)制的關(guān)鍵區(qū)域。HBV基因組已經(jīng)確定在負鏈DNA核苷酸序列為模板轉(zhuǎn)錄的RNA上含有4個公認的開放閱讀框，分別成為S、C、P、X區(qū)。13、丙型肝炎病毒基因組（HCV)的結(jié)構(gòu)：呈球形顆粒，直徑約50nm，有一脂質(zhì)包膜?；蚪M為單鏈正鏈RNA病毒，鏈長約9.5kb,整個基因組只有一個ORF，編碼3011或3010個氨基酸。5端和3端分別有短的非編碼區(qū)（UTR) 。5端UTR由324-341個核苷酸組成，可能在病毒的復(fù)制和翻譯過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。5端UTR的核苷酸序列保守性強

8、，可用于基因檢測診斷。3端UTR由27-55個核苷酸組成，其長度取決于病毒的來源，由病毒固有順序與各種長度的“多U序列”組成，是HCV的獨特結(jié)構(gòu)。HCV基因產(chǎn)物均來自一個大的多蛋白前體，經(jīng)宿主與病毒編碼的蛋白酶的聯(lián)合作用，在翻譯中或翻譯后被加工成為結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白包括兩種：核心蛋白和包膜糖蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白包括四種：NS2、NS3、NS4、NS5。14、人類免疫缺陷病毒基因組（HIV）的結(jié)構(gòu)：（主要有兩型：HIV-1和HIV-2。兩型病毒的核苷酸序列差異超過40%，世界范圍的AIDS大多由HIV-1所致，HIV-2只在西非呈地區(qū)性流行。）HIV基因組由2條相同的正鏈RNA在5端通過

9、氫鍵互相連接在一起形成二聚體，其單鏈RNA含有9749個核苷酸。HIV基因組共有9個基因，其中3個是結(jié)構(gòu)基因，6個是調(diào)控基因。在病毒基因組的5端和3端各有相同的一段核苷酸序列，稱為長末端重復(fù)序列（LTR)。LTR中含有啟動子、增強TATA序列等，它們對病毒基因組轉(zhuǎn)錄的調(diào)控起關(guān)鍵作用。15、質(zhì)粒的一般性質(zhì)：質(zhì)粒作為一個完整的復(fù)制子，在轉(zhuǎn)化菌細胞后能自主復(fù)制，并對細菌的一些代謝活動和抗藥性表現(xiàn)具有一定的作用。在質(zhì)粒只有在宿主細胞內(nèi)才能完成自我復(fù)制，一旦離開宿主細胞就無法復(fù)制和擴增，相反，宿主細胞失去了質(zhì)粒依舊能存活。質(zhì)粒也是一種游離基因，既可整合到細菌染色體中，又可在游離出來。質(zhì)粒具有不相容性。1

10、6、基因結(jié)構(gòu)異常：廣義上是指染色體畸變和基因突變，狹義上一般是指基因突變。17、基因結(jié)構(gòu)異常的類型：通常分為單基因病和多基因病。單基因病包括：三聯(lián)體重復(fù)、血紅蛋白病、苯丙酮尿癥和遺傳性原發(fā)痛風。多基因病包括：原發(fā)性高血壓、糖尿病和實體瘤。18、端粒：真核細胞染色體末端存在著一種由DNA片段和蛋白質(zhì)組成的獨特結(jié)構(gòu)，即為端粒。它對維持染色體的穩(wěn)定性具有重要作用。19、端粒的主要作用：（1）維持染色體的穩(wěn)定性，防止染色體重組及末端被降解。（2）保證細胞在有絲分裂時染色體準確的分離，在減數(shù)分裂是保證染色體的成對及運動。（3）端粒在細胞生長中有很大的作用，其與腫瘤和衰老有關(guān)。20、人類基因組：包括細胞核

11、內(nèi)的核基因組和細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體基因組。核基因組由3.1610bp組成，線粒體基因組由16569bp組成。21、核酸：是以核苷酸為基本組成單位的生物信息大分子。（天然存在的核酸有兩類，即DNA和RNA。）22、核酸分離純化應(yīng)遵循的原則：一是保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性，因為完整的一級結(jié)構(gòu)是核酸結(jié)構(gòu)和功能研究的基本要求；二是盡量排除其他分子的污染，保證核酸樣品的純度。23、簡述核酸分離純化技術(shù)路線的設(shè)計：（1）核酸的釋放：細胞破碎方法中機械剪切法不能用于基因組DNA的提??；非機械法常用化學試劑或酶細胞溶解法。（2）核酸的分離與純化：除去蛋白質(zhì)、多糖、脂類等大分子物質(zhì)；除去非目的核酸組分；除去實驗溶液和

12、試劑。（3）核酸的濃縮、沉淀于洗滌：濃縮：提高樣品濃度；沉淀：常用的濃縮方法，如醋酸鈉、醋酸銨等；洗滌：除去共沉淀的鹽，常用70%-75%的乙醇。24、簡述酚抽提法分離純化基因組DNA的方法，并繪制出流程示意圖：（1）將分散好的真核生物組織、細胞在含EDTA、SDS及無DNA酶裂解緩沖溶液裂解細胞，破壞細胞膜、核膜，EDTA能抑制細胞中DNA酶的活性，使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中。SDS主要引起細胞膜的降解并能乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使它們沉淀，同時還有降解DNA酶的作用。再經(jīng)蛋白酶K處理后，用PH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀進一步

13、純化，此法可獲得100-200kb的DNA片段。（2）書本82頁25、簡述低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法如何回收基因組DNA，有何優(yōu)點：本方法是從低熔點瓊脂糖凝膠中切出含待回收的DNA凝膠塊，利用其純度高、熔點低及凝固溫度低的特點，對DNA片段回收的方法。該法對高分子量的DNA特別有用，也能有效的分離小分子量的DNA片段。26、質(zhì)粒DNA純化的主要方法與原理：（1）cscl-EB法：是一種沉降平衡離心法。經(jīng)超速離心，離心介質(zhì)cscl形成一連續(xù)的密度梯度，在過量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。該法主要用于純化容易出現(xiàn)切口的極大質(zhì)粒DNA和具有某些特殊用途的閉環(huán)質(zhì)粒DNA。（

14、2）聚乙二醇沉淀法：是一種分級沉淀法。質(zhì)粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA，然后在高鹽條件下，用PEG選擇性地沉淀大的質(zhì)粒DNA，沉淀的質(zhì)粒DNA進一步用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。PEG沉淀法簡單、經(jīng)濟、試用廣泛，尤其對堿裂解法提取的質(zhì)粒純化效果好，適用于分子克隆中所有常規(guī)的酶學反應(yīng)，也能用于高效的哺乳動物細胞學的轉(zhuǎn)染。但不能有效分離帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA與閉環(huán)質(zhì)粒DNA。（3）柱層析法：柱層析法純化質(zhì)粒DNA的關(guān)鍵是用于填充層析柱的樹脂。樹脂可分兩類：一類是利用疏水的相互作用純化質(zhì)粒DNA樣品；另一類是通過離子交換與吸附的相互作用進行純化。以硅基質(zhì)作

15、為填充材料的柱層析作用原理是：在多鹽條件下，依靠DNA與硅基質(zhì)的可逆性結(jié)合進行純化。多鹽造成磷酸二酯骨架的脫水，通過暴露的磷酸鹽殘基，是DNA吸附到硅基質(zhì)上。以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖類等生物大分子后，加入TE緩沖液或水溶液使DNA分子重新水合，并通過離心洗脫出來。DNA與硅基質(zhì)的吸附作用與DNA的堿基組成和拓撲結(jié)構(gòu)無關(guān)，因此可用于環(huán)形質(zhì)粒DNA和線性DNA的純化。由于100-200bp的DNA分子與硅基質(zhì)的吸附力很弱，因此柱層析不能用于小分子DNA片段的純化。27、簡述RNA提取的關(guān)鍵步驟：91頁28、DNA重組：不同來源的DNA通過磷酸二酯鍵連接而重新組合成新的DNA分子的過程，稱為

16、DNA重組。29、DNA重組技術(shù)（分子克隆或基因工程）：用人工手段對DNA進行改造和重新組合的技術(shù)。包括對DNA分子的精細切割、部分序列的去除、新序列的加入和連接、DNA分子擴增、轉(zhuǎn)入細胞的復(fù)制繁殖、篩選、克隆、鑒定和序列測定等等，是基因工程技術(shù)的核心。 30、克?。簛碜酝皇甲娴南嗤北净蚩截惖募?。31、DNA克隆：是指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，在體外對DNA進行重組，構(gòu)建成具有自主復(fù)制能力的重組DNA分子，再導入宿主細胞，然后從單個細胞開始大量擴增，最終獲得大量同一的DNA分子。32、限制性內(nèi)切酶：是存在于細菌體內(nèi)，能識別和水解雙鏈DNA分子內(nèi)特定序列的核苷酸水解酶類。33、DNA連接酶：催化

17、雙鏈DNA或RNA中并列的5-磷酸和3-羥基之間形成磷酸二酯鍵的酶。34、載體：時攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。35、作為載體應(yīng)具備的條件：在宿主細胞中具有自主復(fù)制能力或能整合到宿主染色體上與染色體基因組一同復(fù)制的能力；有合適的限制性酶切位點供外源DNA片段插入；分子量不宜過大，以便于容納較大的外源DNA片段并獲得較高的拷貝數(shù)，也有利于體外重組操作；具有合適的篩選標記，以便于區(qū)分陽性重組體和陰性重組體，常用的篩選標記有抗藥性、酶基因、營養(yǎng)缺陷型或形成噬菌斑的能力等；配備與宿主相適應(yīng)的調(diào)控元件，如啟動子、增強子和前導序列等。36、用作克隆載體的理想質(zhì)粒應(yīng)具備

18、的特點：具有松弛復(fù)制子，復(fù)制子是質(zhì)粒自我增殖所必不可少的基本條件，并可協(xié)助維持使每個細胞含有一定數(shù)量的質(zhì)?？截?；在復(fù)制子外存在數(shù)個單一的酶切位點，以便目的DNA片段插入；具有插入失活的篩選標志，理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具有兩種抗生素抗性標志；分子量相對較小和較高的拷貝數(shù)。*37、重組DNA的步驟：獲得目的基因；與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；用重組DNA分子轉(zhuǎn)化或感染宿主細胞，并能在宿主細胞中復(fù)制和遺傳；對重組子的篩選和鑒定；DNA序列測定。38、原核生物表達體系對外源目的基因的要求：要求真核生物的目的基因不應(yīng)具有5端非編碼區(qū)以及內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。39、原核生物表達載體的特點：含大腸桿菌適宜的選擇標

19、志；具有能調(diào)控轉(zhuǎn)錄、生產(chǎn)大量mRNA的啟動子；含適當?shù)姆g調(diào)控序列；含合理設(shè)計的多接頭克隆位點，以確保目的基因按一定的方向與載體正確連接。40、真核生物基因在原核細胞中的表達類型：包括融合型表達蛋白、非融合型表達蛋白和分泌型表達蛋白。41、酵母重組表達蛋白的分離與純化：包括酵母細胞內(nèi)表達的蛋白和分泌型蛋白的分離與與純化。（1）酵母細胞內(nèi)表達的重組蛋白的分離與純化：這種蛋白質(zhì)的分離與純化過程比較簡單，以-蛋白酶抑制劑的純化為例：收集酵母細胞玻璃珠破碎離心取上清液DEAE Sepharose柱層析梯度洗脫收集活性部分濃縮葡聚糖凝膠G75柱層析收集、濃縮SDS-PAGE純度鑒定。（2）酵母表達分泌型

20、重組蛋白的分離與純化：以酵母表達干擾素純化為例：發(fā)酵液用0.45um孔徑濾膜過濾濃縮DEAE-Trisacryl柱層析梯度洗脫收集干擾素部分SephadexG75柱層析洗脫收集干擾素稀釋層析聚焦緩沖液洗脫電泳鑒定。42、RNAi（小干擾RNA）的作用機制與設(shè)計原則：（1）作用機制：起始階段：外源的DsRNA通過導入或者轉(zhuǎn)基因、病毒感染、轉(zhuǎn)座子活化及特異重復(fù)序列或其他未知方式進入細胞，被Dicer酶識別并將dsRNA切割成21-23個核苷酸的由正反義鏈組成的小分子干擾RNA（siRNA)；效應(yīng)階段：siRNAs的雙鏈結(jié)構(gòu)需被解螺旋后組裝到RNA誘導的沉默復(fù)合物中，該復(fù)合物中解旋酶活性將siRNA

21、雙鏈解開，并定位到siRNA的反義鏈互補的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上，在距離siRNA312個堿基的位置切割mRNA；倍增階段：僅需少量siRNA即可引起強烈的同源基因表達抑制。（2）設(shè)計原則：siRNA中G+C堿基含量：一般為30%-70%，50%時siRNA產(chǎn)生的沉默效應(yīng)較高，但過高的G+C堿基含量會降低沉默活性；siRNA的作用位點：一般選擇2-4個不同序列針對目的DNA，3端非編碼區(qū)域可以作為目的序列，避免選擇起始密碼下游500-100個堿基處、終止密碼上游100堿基處及5端非編碼區(qū)域，因為此區(qū)域中含有阻止靶向識別的蛋白質(zhì)結(jié)合位點； siRNA序列：避免連續(xù)四個以上腺嘌呤及3個鳥嘌呤或胞嘧啶核

22、苷酸的序列；siRNA堿基數(shù)：選擇以A或G開始的21-23堿基大小的目的mRNA；環(huán)堿基數(shù)：一般為9個堿基，其序列為TTCAAGAGA；對照系統(tǒng)：將以設(shè)計的siRNA堿基序列隨機排列，以保證與其他基因無同源性，才可作為實驗的對照系統(tǒng)。43、核酸分子技術(shù)雜交：單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程稱作核酸分子雜交。44、探針：是用放射性核素或非放射性物質(zhì)標記的一段單鏈或雙鏈核苷酸，可依堿基配對規(guī)律與具有互補序列的待測核酸進行雜交，以探測它們的同源程度。45、變性：在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，DNA分子成為單鏈，形成無規(guī)則線團，這一過程稱作

23、變性。46、融解溫度：DNA的變性會在一個狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，這一溫度范圍的中點被稱為溶解溫度。47、復(fù)性：變性DNA只要消除變性條件，具有堿基互補區(qū)域的單鏈又可以重新結(jié)合形成雙鏈，這一過程稱之為復(fù)性。48、雜交：將一種核酸單鏈標記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行堿基互補配對，可以形成異源核酸分子的雙鏈結(jié)構(gòu)，這一過程稱作雜交。49、核酸分子雜交原理：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴格按照堿基互補的原則進行，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也能在DNA和RNA之間進行。因此，當用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時

24、，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。50、雜交核酸分子的種類：液相雜交、固相雜交、原位雜交和基因芯片技術(shù)。51、原位雜交：是應(yīng)用核酸探針與組織或細胞中的核酸按堿基互補配對原則進行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應(yīng)用組織化學或免疫組織化學法在顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位的檢測技術(shù)。52、試述Southern印記雜交的基本操作步驟：149頁53、簡述核酸分子雜交過程：包括核酸分子與固相介質(zhì)的結(jié)合、雜交和雜交后信號的檢測3個過程。而雜交又可分為預(yù)雜交、雜交和洗脫三個步驟。54、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）： 一種在體外特異性地復(fù)制已知序列的DNA片段的重要技術(shù)。55、PCR反應(yīng)原理及反應(yīng)過程：（1）原理：PCR技術(shù)的基本