ATP敏感鉀通道在硫化氫鈉對(duì)抗β-淀粉樣肽誘導(dǎo)細(xì)胞損傷

1、敏感鉀通道在硫化氫鈉對(duì)抗-淀粉樣肽誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用作者：廖新學(xué)， 唐小卿， 郭瑞鮮， 楊春濤， 劉微， 陳培熹， 馮鑒強(qiáng) 作者單位：中山大學(xué) 附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，高血壓血管科 【摘要】 【目的】 探討ATP敏感性鉀通道 (KATP) 在硫化氫(H2S) 對(duì)抗-淀粉樣多肽 (A) 誘導(dǎo)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)細(xì)胞損傷中的作用?！痉椒ā?應(yīng)用硫化氫鈉 (NaHS) 作為H2S 的供體，碘化丙啶 (PI) 染色流式細(xì)胞技術(shù) (FCM) 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化， 羅丹明123 (Rh123) 染色FCM檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位 (MMP)，雙氫羅丹明123 染

2、色FCM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧 (ROS) 的含量。【結(jié)果】 20 mol/L和40 mol/L A25-35能明顯地誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞凋亡率，并能明顯地抑制PC12細(xì)胞MMP及增加細(xì)胞內(nèi)ROS生成;100 mol/L和200 mol/L NaHS本身不損傷PC12細(xì)胞，但能明顯地抑制A25-35的致細(xì)胞凋亡作用，降低PC12細(xì)胞的凋亡率，并能顯著地抑制A25-35引起的MMP降低及胞內(nèi)ROS水平增多;在應(yīng)用NaHS與A25-35作用PC12細(xì)胞之前30 min，應(yīng)用KATP抑制劑Glybenclamide (Gly) (10 mol/L) 對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，能部分地對(duì)抗NaHS

3、的細(xì)胞保護(hù)作用，使PC12細(xì)胞凋亡率增加，MMP降低及ROS生成增多?！窘Y(jié)論】 NaHS能明顯對(duì)抗A25-35對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用，此細(xì)胞保護(hù)作用可能與NaHS保護(hù)PC12細(xì)胞的MMP及抑制胞內(nèi)ROS生成有關(guān);KATP通道抑制劑Gly能部分地阻斷NaHS的細(xì)胞保護(hù)作用，提示KATP通道開放可能是NaHS對(duì)抗A25-35損傷作用的機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】 硫化氫;-淀粉樣多肽;線粒體膜電位;活性氧;ATP敏感性鉀通道 Role of ATP-Sensitive K+ Channels in Protection of NaHS against -amyloid Peptide-Induced

4、Damage in PC12 Cells LIAO Xin-xue， TANG Xiao-qing， GUO Rui-xian， YANG Chun-tao， LIU Wei， CHEN Pei-xi， FENG Jian-qiang (Department of Cardiovasology and Department of Hypertension and Vascular Diseases， The First Affiliated Hospital， Guangzhou 510080， China; Department of Physiology， Zhongshan Medica

5、l College， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China; Department of Physiology， Nanhua University， Hengyang 421001， China) Abstract： 【Objective】 To explore the role of ATP-sensitive K+ channels in the protection of hydrogen sulfide (H2S) against -amyloid-induced injury in PC12 cells. 【Methods】

6、 Sodium hydrosulfide (NaHS) was used as a H2S donor. The percentage of apoptotic cells was assessed by propidium iodide stain flow cytometry(FCM). The morphological change of apoptotic cells was tested by using the chromatin dye Hoechst 33258. The mitochondrial membrane potential (MMP) was analyzed

7、by rhodamine 123 stain FCM. The level of reactive oxygen species (ROS) in PC12 cells was measured by dihydrohodamine 123 stain FCM. 【Results】 Amyloid -peptide 2535 (A25-35) at 20 mol/L and 40 mol/L significantly induces PC12 cells apoptosis; and inhibits MMP and induces ROS in PC12 cells. NaHS at 10

8、0 mol/L or 200 mol/L alone did not damage PC12 cells，but obviously attenuated A25-35 induced apoptosis，and blocked the dissipation of MMP and the over-production of ROS induced by A25-35;The ATP-sensitive K+ channel (KATP) inhibitor， glybenclamide(Gly)，which was pretreated 30 min before co-administr

9、ation of NaHS and A25-35， obviously and partly blocked the cytoprotection of NaHS， increasing the percentage of apoptosis; Furthermore， Gly at 10 mol/L partly and significantly blocked the preservation of MMP and inhibition of overproduction of ROS afforded by NaHS. 【Conclusion】 NaHS obviously prote

10、cted PC12 cells against the damage induced by A25-35， the cytoprotection of NaHS was associated with the preservation of MMP and inhibition of ROS over-production; KATP channel inhibitor， Gly， significantly partly blocked the cytoprotection of NaHS， indicating that KATP channels activation played an

11、 important role in the protection of NaHS against PC12 cells damage induced by A25-35. Key words： hydrogen sulfide; -amyloid peptide; mitochondrial membrane potential; reactive oxygen species; ATP-sensitive K+ channels 近年，內(nèi)源性氣體信號(hào)分子如一氧化氮(nitric oxide， NO)1和一氧化碳(carbon monoxide，CO)2在體內(nèi)病理生理過(guò)程中的重要作用日益受到

12、重視;目前，越來(lái)越多的證據(jù)支持內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是體內(nèi)第3種氣體信號(hào)分子3， 其具有多種的生理作用， 例如調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)，影響海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation， LTP)4及舒張血管5等。有研究指出，腦內(nèi)H2S的濃度可達(dá)到50 160 mol/L4。阿爾茨海默病(Alzheimer?蒺s disease，AD)患者腦內(nèi)的H2S水平約降低55%6，提示H2S可能涉及AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。 現(xiàn)已證實(shí)，AD患者腦內(nèi)存在老年斑塊(senile plagues)，其主要成分是-淀粉樣肽(amyloid -peptide，A)。A通過(guò)誘發(fā)氧化應(yīng)

13、激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡(apoptosis)在AD的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用7，8。 最近，我們觀察到，硫化氫鈉(sodium hydrosul-fide， NaHS， H2S的供體)能對(duì)抗A誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12(pheochromocytoma cells， PC12細(xì)胞)凋亡9，但其機(jī)制尚未明了。H2S被認(rèn)為是內(nèi)源性ATP敏感性鉀通道的開放劑(ATP-sensitive K+ channels opener)，因此，本文旨在探討ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+ channels， KATP)在H2S對(duì)抗A-誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的作用。 1 材料與方法 1.1 主

14、要試劑 碘化丙啶(PI)、Rnase A、甲氮甲唑藍(lán)(MTT)、羅丹明123(Rh1233)、雙氫羅丹明(DHR)、A2535，ATP敏感性鉀通道抑制劑Glybenclamide與NaHS購(gòu)自Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清購(gòu)自Gibico BRL公司(NY USA)。 1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，培養(yǎng)于含100 mL/L馬血清、50 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。于37 、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組;不同濃度A25-35損傷組：分別應(yīng)用20 mol/L 和4

15、0 mol/L A25-35作用PC12細(xì)胞24 h;不同濃度NaHS單純作用組：分別應(yīng)用100 mol/L和200 mol/L NaHS孵育PC12細(xì)胞24 h;NaHS+A25-35共同作用組：分別應(yīng)用不同濃度(100 mol/L與200 mol/L)NaHS與不同濃度(20 mol/L與40 mol/L)A25-35共同作用PC12細(xì)胞24 h;ATP敏感性鉀通道抑制劑+NaHS+A25-35作用組。 1.3 PI染色流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡 收集多組細(xì)胞，用PBS洗2遍，用700 mL/L 乙醇4 固定過(guò)夜，取106已固定的細(xì)胞，用PBS洗兩遍，去上清后加入300 L

16、DNA染液(內(nèi)含PI 100 g/mL和Rnase A 20 單位/mL)，于4 冰箱中放置45 min，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀(美國(guó)BENKMAN-COULTER公司出品)檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm;發(fā)射波長(zhǎng)：610 nm)細(xì)胞DNA的含量。以DNA組方圖中低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細(xì)胞數(shù)的多少。 1.4 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 把PC12 細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，按實(shí)驗(yàn)分組要求給以下不同的處理因素作用一定時(shí)間，加入新鮮配制的40 g/L多聚甲醛，4 固定細(xì)胞10 min，加入5 mg/L Hoechst 33258 染色液作用10 min，PBS沖洗，熒

17、光顯微鏡下觀察、攝片。正常細(xì)胞核呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，記為凋亡細(xì)胞。 1.5 細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè) Rh123是一種為線粒體所吸收的熒光染色，其吸收值隨線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的改變而呈相應(yīng)的變化，從而改變細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。因此，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞RH123的熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞的MMP。藥物處理24 h后， 用0.25 g/L 胰蛋白酶消化貼壁的PC12細(xì)胞， 收集1 × 106細(xì)胞，用PBS 洗兩次。取儲(chǔ)存于-20溶于DMSO的1 g/L Rh123，用不含小牛血清的RPMI-164

18、0 稀釋至100 g/L，重懸上述細(xì)胞，避光于37孵育45 min 后進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)定(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)，測(cè)定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)10 000 個(gè)活細(xì)胞， 以陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示MMP。 1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的檢測(cè) 按前文9介紹的方法測(cè)定細(xì)胞ROS的含量，即用雙氫羅丹明處理PC12細(xì)胞12 h后傾去陳舊培養(yǎng)基， 用無(wú)血清的RPMI-1640洗2次， 加入用無(wú)血清的RPMI-1640稀釋的終濃度為1 mol/L的雙氫羅丹明， 避光于37孵育1 h 后， 收集細(xì)胞，PBS洗1次， 制成1 × 108/L 的懸液

19、，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)，測(cè)定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。每個(gè)樣品測(cè)定10 000個(gè)活細(xì)胞， 直方圖分析Rh123的平均熒光強(qiáng)度(MFI)，該值即代表細(xì)胞ROS的水平。 1.7 統(tǒng)計(jì)分析 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后用最小有意義差異檢驗(yàn)(least significant difference， LSD)進(jìn)行均數(shù)間的多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。 2 結(jié)果 2.1 NaHS抑制A25-35誘導(dǎo)

20、的細(xì)胞凋亡 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示， 20 mol/L A25-35 處理PC12 細(xì)胞24 h 后， PC12細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征， 如細(xì)胞核濃縮等(圖1C)。100 mol/L NaHS自身不引起PC12細(xì)胞凋亡(圖1B)， 但其與20 mol/L A25-35共同處理PC12細(xì)胞24 h，能使A25-35引起的具有凋亡特征的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖1D)。FCM檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析也顯示， 100 mol/L和200 mol/L NaHS均能顯著地降低20 mol/L 和40 mol/L A25-35引起的PC12 細(xì)胞凋亡率(P < 0.01，圖1)

21、 。 2.2 KATP通道抑制劑拮抗NaHS引起的抗細(xì)胞凋亡作用 H2S被認(rèn)為是KATP通道的開放劑(Opener)，為了探討KATP通道開放是否與NaHS對(duì)抗A25-35引起PC12細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。本文在應(yīng)用100 mol/L NaHS與20 mol/L A25-35作用PC12 細(xì)胞之前30 min，應(yīng)用10 mol/L KATP通道的抑制劑Glybenclamide (Gly) 對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理 (pretreatment)。圖2的結(jié)果顯示，10 mol/L Gly自身不影響PC12細(xì)胞的凋亡率，但是卻能顯著地部分地拮抗100 mol/L NaHS對(duì)抗20 mol/L A25

22、-35的致凋亡作用 (P < 0.01)，提示NaHS的細(xì)胞保護(hù)作用可能與其開放KATP通道有關(guān)。 2.3 KATP通道抑制劑拮抗NaHS抑制A25-35降低MMP的作用 MMP降低是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)重要特征。Rh123熒光染色法可檢測(cè)熒光強(qiáng)度的大小反映MMP的改變。圖3顯示，PC12細(xì)胞經(jīng)20 mol/L A25-35作用6 h后，MMP明顯降低(圖3D)，100 mol/L NaHS本身不影響Rh123熒光強(qiáng)度(圖3B)，但當(dāng)其與20 mol/L A25-35共同作用PC12細(xì)胞6 h后，NaHS能顯著地抑制20 mol/L A25-35引起的MMP降低(圖3E)。圖3G為FCM的

23、平均熒光檢測(cè)強(qiáng)度(MFI)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，同樣顯示NaHS能明顯地抑制A25-35引起PC12細(xì)胞MMP降低。 為了探討KATP通道開放是否參與H2S的保護(hù)MMP作用，本文觀察KATP通道抑制劑Gly (10 mol/L) 預(yù)處理(預(yù)處理方法與上述的方法相同)對(duì)H2S抑制A25-35降低MMP作用的影響。圖3C與G的結(jié)果表明，10 mol/L Gly本身對(duì)PC12細(xì)胞的MMP無(wú)明顯影響，但是能明顯地部分地阻斷NaHS抑制MMP降低的作用(圖3F和G，P < 0.01)，提示NaHS抑制A25-35降低MMP作用的機(jī)制之一可能與其開放KATP通道有關(guān)。 2.4 KATP通道抑制劑對(duì)NaHS抑制

24、ROS生成增多的影響 圖4顯示PC12細(xì)胞被20 mol/L A25-35處理3 h后，其胞內(nèi)的雙氫羅丹明熒光強(qiáng)度明顯增多(圖4D與正常對(duì)照組圖4A比較)，提示A25-35引起胞內(nèi)ROS生成增多。然而當(dāng)自身不影響ROS生成(圖4B)的100 mol/L NaHS與20 mol/L A25-35共同作用于PC12細(xì)胞3 h后， 胞內(nèi)的雙氫羅丹明熒光強(qiáng)度顯著減小(圖4E)，提示NaHS能抑制A25-35引起的PC12細(xì)胞ROS生成增多。值得注意的是，KATP通道抑制劑Gly(10 mol/L) 預(yù)處理能明顯地拮抗NaHS抑制ROS生成作用(圖4F)，提示KATP通道開放可能在H2S抑制胞內(nèi)ROS生

25、成中起著一定的作用。10 mol/L Gly本身不影響ROS水平(圖4C)。 3 討論 老年性癡呆(AD)是一種神經(jīng)性退行性疾患，其病理特征是腦內(nèi)呈現(xiàn)老年斑(senile plagues)。A是細(xì)胞外老年斑的主要成分。A來(lái)源于淀粉樣前體蛋白 (amyloid precursor protein，APP) 的蛋白水解物，具有39 43個(gè)氨基酸，其中25 35片斷被認(rèn)為具有神經(jīng)毒性，很可能是AD病理機(jī)制的關(guān)鍵10。 為了探討H2S能否對(duì)抗A引起神經(jīng)元損傷及其作用機(jī)制，本文在具有神經(jīng)元的形態(tài)及功能特征的PC12細(xì)胞建立A25-35致細(xì)胞損傷模型，應(yīng)用NaHS作為H2S的供體，觀察不同濃度NaHS對(duì)A

26、25-35損傷PC12細(xì)胞作用的影響。本文的研究結(jié)果表明，20 mol/L40 mol/L A25-35能明顯引起PC12細(xì)胞凋亡(圖1)，并引起MMP降低及胞內(nèi)ROS明顯增多。Wang等人也觀察到A25-35誘導(dǎo)氧化應(yīng)激 (oxidative stress)并引起PC12細(xì)胞凋亡11。 另有研究指出，A能直接地與線粒體基質(zhì) (mitochondrialmatrix)內(nèi)的A結(jié)合乙醇脫氫酶 (A-bindingalcohol dehydrogenase，AAD) 相互作用，從而導(dǎo)致ROS生成增多、線粒體喪失功能及細(xì)胞凋亡12。這些研究支持本文的上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 重要的是本文在證實(shí)了H2S能對(duì)抗A2

27、5-35引起的細(xì)胞凋亡、MMP降低及ROS升高等損傷作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了KATP通道在NaHS抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制中的作用。 H2S是一種作用較強(qiáng)的內(nèi)源性ATP敏感的鉀通道開放劑 (ATP-sensitive K+ channel opener)13。KATP通道開放能保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的凋亡14。本文觀察到KATP通道抑制劑Glybenclamide (Gly)能明顯地部分地阻斷H2S抑制A25-35的細(xì)胞損傷作用，使凋亡率顯著增加，并能部分地拮抗H2S保護(hù)MMP及抑制ROS生成作用，提示KATP通道開放可能是H2S對(duì)抗A25-35細(xì)胞損傷作用的重要機(jī)制之一，值得今后進(jìn)一

28、步探討。 【參考文獻(xiàn)】 Bredt DS， Snyder SH. Nitric oxide， a novel neuronal messenger J. Neuron，1992，8(1)：3-11. Verma A， Hirsch DJ， Glat CE， et al. Carbon monoxide： A putativeneural messengerJ. Science，1993，259(5093)： 381-384. Wang R. Two's company， three's a crowd： can H2S be the third endogenous gaseo

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