常染色體顯性遺傳多囊腎的多囊素表達

1、    常染色體顯性遺傳多囊腎的多囊素表達        【摘要】目的研究多囊素的細胞定位，了解正常腎臟與腎組織多囊素的表達及分布差別。方法應用多囊素合成肽單抗-抗pepPBP1和抗pepPBP3以及融合蛋白抗體-抗fpAH4，對3例正常腎組織和8例多囊腎組織的標本做免疫組織化學染色定位。結果正常腎組織的多囊素組織化學定位主要分布在遠端小管和集合管，髓質部更明顯，近端小管弱染或陰性，腎小球上皮細胞也可著染。8例多囊腎組織的染色細胞在28%60%，大多數(shù)為50%，囊腫上皮染色比

2、正常腎組織強，囊腫上皮染色強弱不同，少數(shù)囊腫上皮染色陰性。結論正常腎組織和多囊腎組織均可表達多囊素，多囊素染色以遠端小管和集合管為主，細胞染色有差異性；多囊腎的囊上皮染色存在異質性?！娟P鍵詞】多囊腎免疫組織化學多囊素 Expression of polycystin in autosomal dominant polycystic kidney diseaseYE Chaoyang*，Dominique Droz.*Department of Nephrology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shangha

3、i 200003【Abstract】ObjectiveIn order to identify the localization of polycystin(PC) in the cells and understand the expression and distribution difference of PC in the normal kidney and polycystic renal tissue. MethodsThe antibodies against 2 synthetic peptides, pepPBP1 and pepPBP3, and a fusion prot

4、ein fpAH4 corresponding to the predicted amino acid sequence of PC were used for immunostaining of normal renal and polycystic tissues. ResultsIn 3 cases of normal tissue ,PC was mainly localized to distal and collective tubeles with a finely granular cytoplasmic staining, especially in the medulla;

5、 proximal tubules was faintly positive or negative. In 8 cases of polycystic kidney, 28%60% of the cells were positive, being near 50% in the majority of cases; approximately 80% of non-cystic tubules expressed PC and cells staining were stronger positive than normal kidney. ConclusionPC is expresse

6、d either in polycystic kidney or in normal renal cells; PC is detected in cell lining nearly 50% of cysts wall also exhibiting some intercellular heterogeneity.【Key words】Autosomal dominant polycystic kidney diseaseImmunohistochemistryPolycystin常染色體顯性遺傳多囊腎病（ADPKD）是腎功能衰竭病因中最常見的遺傳病，發(fā)病率為1/1000，多囊腎的發(fā)病目前

7、認為與三個位點有關，即PKD1,PKD2和PKD3。PKD1定位于染色體16p133，PKD2定位于染色體4q1323，但PKD3還未明確定位。多囊腎的基因突變85%90%是PKD1基因突變，PKD1基因目前已被克隆，其產(chǎn)物為多囊蛋白（或稱多囊素）的氨基酸序列業(yè)已查清，它是一個相對分子質量約460的跨膜糖蛋白，有一個很大的細胞外N-末端和一個細胞內(nèi)C-末端尾巴1。盡管多囊素的功能還未澄清，根據(jù)其細胞外的多個功能區(qū)，目前認為它發(fā)揮細胞與細胞、或細胞與間質之間的相互作用。本研究中，我們采用基因克隆多囊素多肽抗體或融合抗體，應用免疫組織化學方法，試探討多囊素在多囊腎組織中的分布和多少，以便進一步推測

8、其功能。材料和方法一、材料8例多囊腎組織標本，均為女性，6例為腎移植前切除腎，2例為多囊腎腹痛切除腎，腎切除時患者已行血液透析1個月至14年不等。正常腎組織來自3例因腎腫瘤行腎切除的非腫瘤腎組織。兩種兔抗鼠多囊素的合成肽單抗-抗pepPBP1 和抗pepPBP3以及一種多囊素融合蛋白單抗-抗fpAH4 由荷蘭的D. Peter 教授贈送。fpAH4 和pepPBP1均位于目前認定的多囊素蛋白的細胞漿部分（即羧基端），pepPBP3多肽位于多囊素基因第24個外顯子編碼區(qū)（第2961-2975氨基酸），這三種抗體具有相同的免疫組織化學染色2。正常兔血清作為陰性對照。二、方法腎臟組織標本福爾馬林固定

9、，石蠟包埋切片，切片厚度4 m。內(nèi)源性過氧化酶用3%雙氧水處理5分鐘，內(nèi)源性生物素活性用生物素抑制試劑合（Dako,Denmark）抑制。多囊素抗原恢復處理如下：切片浸入pH 6.0的枸櫞酸緩沖液，微波爐處理4分鐘，反復3次，原抗體適當稀釋（1/2001/600），加到切片上，孵育一小時；免疫酶標染色應用LSAB2 過氧化酶試劑盒（Dako Denmark）,用3-氨基-9-乙基-卡巴砷作為顯色底物；組織切片再用蘇木素逆染。每例標本均做連續(xù)切片，分別用三種抗體和正常兔血清染色。為了確定囊腫的來源，3例多囊腎標本作了連續(xù)切片，應用花生刀豆素過氧化酶染色，分別鑒定遠端、近端小管和集合管?？筬pAH

10、4融合蛋白抗體也采用過氧化酶法用于囊腫和腎小管多囊素表達的檢測，刀豆素標記的過氧化酶采用二氨基苯乙啶為底物，顯褐色。結果一、多囊素在正常腎組織的表達 在正常腎組織中三種抗體均有著染，三種抗體的免疫組織化學染色強度相近；而用正常兔血清處理的腎組織標本染色完全陰性。在腎小球，足細胞的著染主要在胞漿，靠近核周圍，壁層上皮染色很弱且散在；系膜細胞和內(nèi)皮細胞不著染。遠端小管和集合管染色強陽性伴有細顆粒的胞漿著色，集合管的頂端和底部清楚著色，髓質部更為明顯；近端小管弱染或陰性。二、多囊素在多囊腎組織的表達多囊素在多囊腎的表達比正常腎組織更為強染色。1.腎囊腫組織：在所研究的8例多囊腎組織，多囊素在囊襯里上

11、皮細胞的胞漿中檢測到。這8例的少數(shù)囊上皮染色陰性。多囊素染色陽性的細胞占28%60%，大多數(shù)為50%（1），此外，即使在同一個囊腫的上皮細胞，6/8例腎組織囊腫細胞的著染存在差異性，某些陰性染色的囊上皮細胞比鄰的細胞可以出現(xiàn)陽性染色；即染色存在異質性。2.非囊腫腎組織的多囊素表達（2）：組織化學染色所見約80%的非囊腫的腎小管表達多囊素，免疫染色呈顆粒狀，在某些腎小管的細胞膜（頂端和基底部）染色增強，尤其在集合管。在著染的陽性細胞也存在差異性，陽性細胞的臨近細胞也可有陰性細胞，增生肥大的腎小管細胞染色強陽性。在腎小球，上皮細胞染色陽性如同正常組織。1多囊素在多囊腎囊腫表達的免疫組織化學染色（光

12、鏡×400）2多囊素在非囊腫腎組織的表達情況（光鏡×400）討論越來越多的研究表明，多囊素（或稱多囊蛋白）是遺傳性多囊腎病的重要因素，應用多囊素單克隆抗體或多克隆抗體檢測多囊素在腎臟的表達已有報道3-5，各家的報道不盡相同，但都認為多囊素既可在多囊腎囊腫上皮表達，也可在正常成熟的腎臟表達。我們的研究表明，多囊素在正常腎小管上皮細胞表達，主要是在遠端小管和集合管，而近端小管基本上是陰性的，本組的石蠟切片標本，多囊素的免疫組織化學染色主要是呈胞漿性，細胞膜染色或核周染色也可見到。一般認為，這與所用抗體（單抗或多抗）和組織處理（福爾馬林或冰凍切片）有關；本組所用基因重組抗體是抗多

13、囊素的胞漿部分，其結果也相吻合。這些觀察結果支持目前所認定的多囊素作用，即多囊素在細胞與細胞或細胞與基質之間發(fā)揮作用。我們的研究表明6，在培養(yǎng)的腎小管上皮細胞，應用共聚焦顯微鏡觀察多囊素定位于單側細胞膜，在細胞與細胞接觸點探測到多囊素；晚近研究表明，雙共聚焦顯微鏡證明多囊素與細胞骨架成分鈣調素（cadherin）位于相同部位；另一組研究證實多囊素與整合素21和肌動蛋白細絲相結合，有趣的是整合素21存在于遠端小管和集合管，而近端小管不存在。本組在成熟的足突細胞檢測到多囊素，染色主要是細胞體，這與個別報道不同（他們在腎小球上皮細胞未檢測到多囊素）。在這些細胞，多囊素的免疫組織化學染色可能與多囊素分

14、子結合到肌動蛋白細絲有關。我們研究所用的ADPKD組織，在囊腫上皮細胞的胞漿有多囊素的強陽性表達，表達陽性率達50%，但存在細胞間的差異性，甚至部分囊腫上皮細胞呈陰性，這種結果可能與囊腫的局部解剖起源有關；也就是說，陰性的囊腫可能來源于近端小管或包曼氏囊，不表達多囊素；而陽性的囊腫來源于遠端小管或集合管，表達多囊素。另一種可能是陰性與陽性囊腫的不同支持這樣一個觀點：ADPKD的發(fā)生與PKD1基因“二次打擊”理論相符；根據(jù)這種理論，陰性囊腫其PKD1基因改變導致整個蛋白丟失，而陽性囊腫細胞的基因改變導致一種無功能的多囊素形成?？傊嗄宜氐墓δ苎芯坎艅倓傞_始，多囊素的結構分析表明，它是一個很大的

15、分子，具有五個細胞外蛋白分子片段區(qū)域，如乳糖結合區(qū)、LDL-A區(qū)、纖維連結蛋白結合區(qū)等；多囊素還具有免疫球蛋白重復區(qū)。多囊素可能具有復雜的功能，在細胞與細胞或細胞與基質之間發(fā)揮作用可能只是其功能的一部分。多囊素的抗體多種多樣，不同節(jié)段的抗體可能出現(xiàn)不同的免疫組織化學結果。多囊素在非ADPKD腎囊腫上皮細胞的表達情況如何以及其作用，都是值得進一步研究的。作者單位：葉朝陽200003 上海，第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院腎內(nèi)科；Dominique DrozService de Nephrologie et INSERM U90,Hospital Necker,75015 Paris,France參考文獻

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