變性高效液相色譜_一種新的基因突變檢測方法

1、收稿:2003年12月,收修改稿:2004年3月 *國家自然科學基金資助項目(No.20271033、20335020*通訊聯(lián)系人 e -mail:nhfangsj 變性高效液相色譜一種新的基因突變檢測方法*方能虎*藺 麗 任吉存 吳 旦(上海交通大學化學系 上海200240摘 要 變性高效液相色譜是近年來發(fā)展起來的一種檢測基因突變及多態(tài)性的新方法。相比其它檢測技術(shù),它具有易普及、經(jīng)濟、快速等特點。本文對該項技術(shù)在國內(nèi)外近幾年的研究進展進行了評述。關(guān)鍵詞 變性高效液相色譜 基因突變 檢測中圖分類號:65717;Q754 文獻標識碼:A 文章編號:1005-281X(200502-0343-07

2、Denaturing High Performance Liquid ChromatographyA Novel Technique for Detection of Genetic Mutation P PolymorphismsFang Nenghu*Lin Li Ren Jicun Wu Dan(Department of Chemistry,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,ChinaAbstract Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLChas been

3、successfully used for the genetic mutation P polymorphisms analysis.Compared with conventional slab gel electrophoresis,this technique is sensitive,ef -fective and economical.The fundamental aspects and the development of the applications of this technique in recent years are revie wed.Key words den

4、aturing high perfor mance liquid chromatography;genetic mutation;detection一、引 言基因突變是指基因組DNA 分子在結(jié)構(gòu)功能上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變,主要包括堿基的替換和小片段的缺失或插入,它是導(dǎo)致基因型疾病的重要原因之一1,2。而多態(tài)性是指在進化過程中已經(jīng)在人群中積累起來的DNA 序列變化?；蛲蛔兗岸鄳B(tài)性分析在生物醫(yī)學研究中,尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。隨著人類基因組整體測序計劃的發(fā)展,探索基因突變及多態(tài)性的任務(wù)變得十分迫切。理想的基因突變及多態(tài)性檢測技術(shù)應(yīng)當具有準確性和敏感性高、完

5、全自動化、檢測成本低等特點,而且在聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PC R引物的修飾及PC R 后處理等方面也不應(yīng)有特殊的要求。傳統(tǒng)的基因突變及多態(tài)性檢測方法大都依賴于平板凝膠電泳技術(shù)3。這些方法或受檢測靈敏度的限制4、或因易于產(chǎn)生假陽性結(jié)果和高成本檢測5,6、或因只能手工操作導(dǎo)致分析時間冗長等原因,不適用于大量臨床樣品分析和大規(guī)模人口掃描分析。近年來毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)為基因突變及多態(tài)性分析提供了一種高效、快速、靈敏、高通量的新方法7,8。然而該技術(shù)需配備昂貴的激光誘導(dǎo)熒光檢測器,且需要尋找合適的熒光標記物,難以在臨床研究和應(yīng)用中普及推廣。高效液相色

6、譜法由于分離效率高、選擇性好以及同時具有分離和檢測功能,已經(jīng)發(fā)展成為分離和分析生物大分子(如核酸、蛋白質(zhì)等的強有力手段。該方法應(yīng)用于核酸研究主要有6種分離模式9:尺寸排阻色譜(size -exclusion chromatography、陰離子交換色譜(anion -e xchange chromatography 、混合模式色譜(mixed -mode chromatography 、反相色譜(reversed -第17卷第2期2005年3月化 學 進 展PROGRESS I N C HE MISTRYVol.17No.2 Mar.,2005phase chromatography、離子對反

7、相色譜(ion -pair re -versed phase chromatography、親和色譜(affinity chrom -atography。在這幾種分離模式中,陰離子交換色譜和離子對反相色譜由于具有較高的分辨能力和分析單、雙鏈DNA 片段大小范圍寬等特點10,11,應(yīng)用較為廣泛。尤其是離子對反相色譜法(IR -RP -HPLC被公認為是檢測核酸較理想的方法12。1986年,Eriksson 等13曾采用以多孔硅膠為載體的PepRPC(C 2P C 18色譜柱分離了DNA 片段。然而,欲分離600bp 以上的DNA 片段需耗時3h 以上,冗長的分析時間限制了該方法在實際分析和制備方

8、面的應(yīng)用。上世紀90年代初,隨著無孔苯乙烯、二乙烯苯共聚物(poly (styrene -divinylbenzene,PS P DVB填料的問世,加快了分析速度,并解決了樣品峰過寬及拖尾等柱效低的問題,才使這一技術(shù)在蛋白質(zhì)分離14及DNA 片段分離等方面的應(yīng)用得以快速發(fā)展15。但發(fā)掘這種技術(shù)的潛在能力并應(yīng)用于探索人類基因組DNA 序列變異卻是在近幾年剛剛興起?；贒NA 變性與復(fù)性對溫度的依賴性,離子對反相高效液相色譜法可以按以下3種方式操作:(1在不變性溫度條件下,高效液相色譜儀類似于凝膠電泳儀,可分離分子量不同的雙鏈DNA 分子,制備分子克隆所需的DNA 片段或分析具有長度多態(tài)性的片段,

9、類似于限制性長度多態(tài)性分析和擴增片段長度多態(tài)性分析;(2在充分變性溫度條件下,該方法能區(qū)分單鏈DNA 或RNA 分子,適用于寡核苷酸合成純度質(zhì)量控制和基于引物延伸的基因型分析;(3在DNA 部分熱變性的溫度條件下,雜合型和野生型的PCR 產(chǎn)物不僅分別形成同源雙鏈,同時也錯配形成異源雙鏈。由于同源雙鏈與異源雙鏈解鏈溫度的差異,使固定相保留它們的能力有所不同。因此根據(jù)保留時間的差異可以分辨異源雙鏈與同源雙鏈,從而識別雜合型。此法也稱為變性高效液相色譜法(denaturing high performance liquid chromatogra -phy,DHPLC。本文著重對近幾年來國內(nèi)外采用第

10、三種分離模式D HPLC 技術(shù)在基因突變及多態(tài)性分析中的應(yīng)用研究進行評述。二、變性高效液相色譜基本原理Oefner16在1995年首次提出變性高效液相色譜的概念,即把在接近DNA 解鏈溫度條件下進行的離 子對反相色譜分析稱為DHPLC 法。1998年Kuklin等17,18把同樣的技術(shù)稱為溫度調(diào)控異源雙鏈分析(temperature modulated heteroduplex analysis,TMHA。2000年我國學者侯一平等19則建議把在接近DNA 解鏈溫度條件下進行的,旨在探索與發(fā)現(xiàn)DNA 序列變異的離子對反相液相色譜技術(shù)稱為溫度調(diào)控高效液相色譜法(temperature -modu

11、lated high -performance liquid chromatography,Tm HPLC。本文仍沿用Oefner 提出的名稱。DHPLC 技術(shù)的原理是基于未解鏈的和部分解鏈的雙鏈DNA 在部分失活條件下具有不同保留的性質(zhì)。這種部分失活條件可以采取升高溫度的手段獲得。所有基因組DNA 的單拷貝均可通過PCR 反應(yīng)大量擴增,雜合子個體的DNA 經(jīng)擴增產(chǎn)生異源雙鏈(heteroduple xes,由于錯配位點的氫鍵被破壞,因此在異源雙鏈上形成/鼓泡(bubble0,導(dǎo)致它與純合子個體的DNA 擴增產(chǎn)物完全匹配的同源雙鏈(homoduplexes的解鏈特征不同。在部分加熱變性的條件下

12、,異源雙鏈DNA 分子更易于解鏈形成Y 形結(jié)構(gòu),與固定相的結(jié)合能力降低。當流動相中乙腈濃度梯度增大時,異源雙鏈將先于同源雙鏈被洗脫出來,帶有突變序列的樣品呈現(xiàn)出異源雙鏈和同源雙鏈混合物的峰形特點,而不含突變序列的樣品則只有同源雙鏈的峰形(圖1。據(jù)此可檢測出含有單個堿基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段,從而提供有無突變的信息,是一種快速、高效、準確、經(jīng)圖1 D HPLC 技術(shù)檢測DNA 序列變異的實驗流程Fig.1 D HPLC for the genetic mu tation analysis#344#化 學 進 展第17卷濟并可半自動化地進行基因突變及多態(tài)性檢測的技術(shù)。三、變性高效液相色譜

13、的色譜柱分離性能優(yōu)越的固定相是色譜分析技術(shù)成功運用的關(guān)鍵。DHPLC技術(shù)的迅速發(fā)展正是得益于新型柱填料的不斷出現(xiàn)。目前,應(yīng)用于DHPLC的色譜柱有以下3類2022:(1使用23L m無孔PS P DVB聚合物微粒,表面鍵合C18固定相作為填料的DNASep o R 分析柱(Transgenomic公司;(2苯乙烯、二乙烯苯單體、引發(fā)劑和致孔劑等混合物在石英毛細管內(nèi)采用原位合成方法制備而成的整體柱(monolithic co-l umn;(3使用315L m硅膠表面鍵合直鏈硅烷固定相作為填料的Zorbax Eclipse dsDNA分析柱(Agilent 公司。DNASep o R分析柱由于采用

14、了表面鍵合C18的熱穩(wěn)定性好、耐高溫的PS P DVB微粒為柱填料,從而保證了分析結(jié)果的準確性和重復(fù)性。利用離子對反相液相色譜模式分離核苷酸,實現(xiàn)了梯度洗脫條件下雙鏈DNA(dsDNA片段的尺寸依賴性分離,而以前只能通過電泳實現(xiàn)2123。Herbert22和Huber20對整體柱的研究結(jié)果顯示該類色譜柱的通透性和重現(xiàn)性好,具有高效和高分辨率地分離單、雙鏈DNA片段的能力。Arnold等24比較了PS P DVB填充柱和PS P DVB整體柱對同源雙鏈和異源雙鏈的分辨能力,在前500次進樣中,兩者沒有顯著差異;但在500次進樣后,整體柱分辨異源雙鏈和同源雙鏈的能力會迅速下降。Huber等20的實

15、驗顯示兩種色譜柱進行核苷酸分離時,整體柱具有較長的洗脫時間,但是兩種色譜柱均可應(yīng)用于基因分析工作中。由于PS P DVB整體柱的使用,在提高通量方面已成為可能25,并且整體柱的一個顯著優(yōu)點是與質(zhì)譜在線聯(lián)用的可行性20。Halee m等26比較了DNASep o R分析柱和Eclipse dsDNA柱分離DNA片段的能力:25e時,Eclipse ds-DNA柱對小片段有較好的分離,而對大片段則分辨率下降;在4050e時兩種柱對不同片段的DNA均有較好的分離效果。DNASep o R分析柱和Eclipse dsD-NA柱在分析同源雙鏈和異源雙鏈時,分辨率上并無顯著差異,但在使用壽命上有較大的差異

16、。Eclipse dsDNA柱由于在中性和堿性環(huán)境中的不穩(wěn)定性,僅能進樣分析10002000次,而且需要在每200次分析后用100%的乙腈沖洗45min進行再生27。而DNASep o R分析柱可以進樣分析超過6000次,且不需要進行特別的再生處理。藺麗等采用Eclipse dsDNA 柱在優(yōu)化的色譜條件下對 X174P Hae digest DNA 的片段進行了分離28,并采用D HPLC技術(shù)對亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T突變進行了分析29,取得了較好的實驗效果。新的研究證實,在完全變性條件下,DHPLC的分辨率已達到能夠?qū)ο嗤叽鐔捂淒NA分子中已知多態(tài)性基因型的單個堿基差異作出檢測

17、,它完全有可能檢測除單個C-G顛換外的所有可能的堿基轉(zhuǎn)換。而且在完全變性條件下, IP-RP-HPLC的高分辨能力和序列依賴性的單核苷酸保留特性相結(jié)合,可以檢測短片段(<100bpPCR 產(chǎn)物30。具有良好的傳質(zhì)性能的固定相也是HPLC分析核酸等生物大分子的重要條件之一。改善生物大分子在固定相上傳質(zhì)性能的途徑主要包括:(1增加孔徑和減小微粒直徑31;(2采用無孔載體填料的固定相32;(3通過使用表面型孔填料來減少孔的深度33;(4引入貫穿固定相顆粒的流通孔34;(5使用整體柱35,36,其分離介質(zhì)是含有微孔、中孔和大孔的多孔高分子聚合物37,38,流動相直接流過孔,通過對流加強傳質(zhì)交換,

18、從而提高柱效3941。四、變性高效液相色譜的檢測方法目前在核酸分析領(lǐng)域與HPLC聯(lián)用的檢測手段有紫外(ultraviolet photometric detector,UV、熒光(flu-orescence detector、質(zhì)譜(mass spec trometry,MS等。其中紫外檢測器(UV憑借其良好的通用性成為應(yīng)用最為廣泛的檢測器,但靈敏度不高的弱點使其使用受到一定的限制42。在核酸分析和一些突變掃描方法中有時需要更高的靈敏度,這時具有更高靈敏度和選擇性的熒光檢測器成為首選43。但是熒光檢測器要求使用熒光標記物,且通常使用的染料如吖啶黃、溴化乙錠44,45是有毒物質(zhì)。Scaiano實驗

19、室開發(fā)出SYB R Green染料46不僅具有更好的靈敏度,而且使用更安全47。激光誘導(dǎo)熒光是目前靈敏度最高的檢測方法之一。Hecker等48采用熒光標記PC R引物、激光誘導(dǎo)熒光方式進行檢測,證明DHPLC方法可以區(qū)別含量相差500倍的兩個等位基因,這使多份樣本的混合檢測成為可能。同時熒光標記單鏈,使色譜圖的解釋變得更加容易。美國Transgenomic公司在WAVE o R核苷酸片段分析系統(tǒng)技術(shù)平臺基礎(chǔ)上,開發(fā)出一種后熒光檢測技術(shù)。在所有分析條件不變的情況下,被檢測的核酸片段經(jīng)DHPLC分離之后在混合室中與熒光試劑混合,然后#345#第2期方能虎等變性高效液相色譜一種新的基因突變檢測方法進

20、行檢測,不僅可以提高靈敏度上百倍,而且不需要昂貴的熒光標記引物49。近年來電噴霧離子化-質(zhì)譜(EIS -MS作為一種重要的結(jié)構(gòu)分析工具與IR -RP -HPLC 聯(lián)用也已應(yīng)用于核酸分析領(lǐng)域50,該聯(lián)用技術(shù)不僅可以確證被分離的單鏈DNA 的成分特性,還可以確證擴增的PC R 產(chǎn)物的基因型20。眾所周知,在核酸的質(zhì)譜分析中為了獲得高置信度的分析結(jié)果,對分析物進行適當?shù)拿擕}和去除小分子量雜質(zhì)是必不可少的51,這也正是HPLC -MS 的魅力所在,但質(zhì)譜的高成本使該項技術(shù)較難推廣使用。五、變性高效液相色譜技術(shù)在基因突變及多態(tài)性分析中的應(yīng)用自O(shè)nfne r 等建立DHPLC 方法以來,美國Trans -

21、genomic 公司開發(fā)出了能以不變性溫度、充分變性溫度和部分變性溫度3種方式操作的離子對反相液相色譜自動分析儀,稱為W A VE TMDNA 片段分析系統(tǒng)。最近Varian 公司也開發(fā)出基于變性高效液相色譜分析的Varian c s ProStar Helix D HPLC 分析系統(tǒng)。在國外已有較多的實驗室和研究中心開始采用W A VETMDNA 分析系統(tǒng),成功地進行基因突變及多態(tài)性的檢測以及疾病相關(guān)性研究25。在國內(nèi)此項技術(shù)也已受到關(guān)注,并開始應(yīng)用于疾病相關(guān)候選基因的突變檢測52,53。表1列出了近年來在這方面的研究情況。從表中可以看出,目前DHPLC 技術(shù)應(yīng)用于基因突變及多態(tài)性分析主要是

22、采用商品化的WAVETMDNA 分析系統(tǒng)。但國內(nèi)外也有一些研究機構(gòu)在普通的高效液相色譜儀上進行DHPLC 分析工作,這些表1 D HPLC 在基因突變及單核苷酸多態(tài)性分析中的應(yīng)用Table Lists of mutation and SNPs screened partly by DHPLCgene diseaseref.genediseaseref.P53n breas t and ovari ancarcinomas as well as lung,col on and skin cancer 54Fanc A n Fanconi ane mia group A 55LPL m coron

23、ary atherosclerotic heart disease52 HPR T nLesch -Nyhan dis eas e Juvenile onset dermatomyositis 56i mmunogl obulin V -region n 57TSC1TSC2n tuberous sclerosis -1、25860CF TR n cys tic fi brosi s 30,61PTEN n gli oblastoma30FBN1nMarfan s yndrome and related connective ti ssue disorders 61 NF1nneurofibr

24、omatosis 62EX T1EX T2n multiple exostoses 63human B -globin n B -thalassemia64,65hM LH1、hMSH2n hereditary nonpolyposis col orec tal cancer 66,67 Y chromosome n68factor IX n hemophilia B 62BRCA1、BRCA2n breas t cancer 6973factor VIII n hemophilia A 74BTK gene n X -linkedaga mmagl obuline mia 75HNF -1A

25、 、GCK n dibetes76D MD P BMDnDuchenne P Becker muscular dys trophy77SUO X gene n autos omal reces sive disease 78G6P T1gene n glycogen storage dis ease 79APP 、PS1、PS2n Alzheimer .s disease 80PKD1、P KD2n autos omal dominantpolycystic ki dney di seas e 81HVR1、HVR2n breas t cancer 82KHSRP n febrileconvu

26、lsions 83APOD n84CYP2A6gene p l ung cancer 85M TM 1n X -linked myotubul ar myopathy86 PRL 、PRLR n multi ple sclerosis 87MPP4n retinitis pigmentosa88GABRG2n s evere myoclonic epileps y of infancy 89HNF -4a n type 2dibetes 90RPGR n retinitis pigmentosa 91PKHD1nautos omal reces sive polycystic ki dney

27、92ATM n gas tric cancer 93AA -N AT(263G P Cn94GAL T genemtrans ferase -deficient galactos ae mia 95TCR -V D 2-D D 3P D D 2-D D 3n chi ldhood acutel ymphoblastic leukemia 96M THFR(C677Tmneural tube defects 、occlusi ve vascular,et al 29,97,98PHA gene n phenylketonuri a(P KU99MCCD1n100n:WAVE TM D NA an

28、alytical s ys te mp :Vari an c s ProStar Heli x D HPLC analytical system m :generalHPLC實驗表明:在有梯度發(fā)生器和色譜柱溫控裝置的普通高效液相色譜儀上進行DHPLC 分析工作是可行的,它為目前以凝膠電泳技術(shù)為基礎(chǔ)進行基因突變分析提供了一種新的、具有普遍適用和推廣意義的技術(shù)選擇。六、結(jié) 論DHPLC 技術(shù)既不需要放射性同位素,也不需要凝膠,操作簡便、經(jīng)濟,真正做到了自動、高效、快速、準確地檢測DNA 片段,且檢測結(jié)果以圖形表示,直觀、易于判斷,為與疾病相關(guān)的基因突變檢測提供了#346#化 學 進 展第17卷一種

29、有效的技術(shù)手段。DHPLC不僅用于已知突變的檢測,還可以用于未知突變的掃描。這項技術(shù)的發(fā)展對于發(fā)現(xiàn)新突變或多態(tài)性,可減少測序工作量。尤其對于鑒別稀少的變異型,可明顯降低成本,加快實驗的進程。此外隨著DHPLC功能不斷地開發(fā)和拓展,還可被廣泛應(yīng)用于DNA微衛(wèi)星鑒定、腫瘤雜合性缺失的檢測、RF-PC R的競爭性定量、人種遺傳學分析、基因作圖、核酸中自身剪切反應(yīng)的研究、DNA片段大小測定、寡核苷酸的質(zhì)量控制和純化、CpG島甲基化的分析及細菌鑒定101,102、mtDNA研究103等許多基因組研究領(lǐng)域以及包括死亡年齡鑒定和性別鑒定等法庭應(yīng)用中104和mRNA的檢測中105,106。和其他方法一樣,DH

30、PLC技術(shù)也有一些不足之處107如:不能直接檢測出純合突變,只能提供個體樣本有無突變的信息,但無法得出具體的突變類型;當有多個片段需要檢測時,由于有多個解鏈溫度,需要多步檢測,增加了工作量等。盡管如此,在目前的檢測手段中,DHPLC仍是一種快速、高效、準確、經(jīng)濟及半自動化篩查基因雜合突變的工具78,優(yōu)于測序等其他分子生物學方法,相信在未來的基因組學研究領(lǐng)域中必將繼續(xù)發(fā)揮重要的作用。參考文獻1Vnencak-Jones C L.Am.J.Cli n.Pathol.,1999,112:S19322Lane D P.Br.J.Cancer,1999,80:153Nollau P,Wagener C.

31、Clin.Chem.,1997,43:111411284Couch F J,Weber B L.Hum.Mutat.,1996,8:8185Wang D G,Fan J B,Si ao C J,et al.Science,1998,280:107710826Hacia J G.Nat.Genet.,1999,21:42477Baba Y.J.Chromatogr.B,1996,687:2713028Ren J C,Deng X Y,Cao Y,et al.Chem.J.Chi nese Uni vers-ities,1996,17:3623669Huber C G.Bi opol ymer C

32、hromatography.Chiches ter:John Wiley&Sons Ltd,2000,2610Gros s T A,Bard M,J arrett H W.J.Chromatogr.,1991,588:15716411Huber C G.J.Chromatogr.A,1998,806:33012師治賢(Shi Z X,王俊德(Wang J D.生物大分子的液相色譜分離與制備(Separation and Preparati on of Biomacromole-cules by Liquid Chromatography,第二版(2nd ed.北京(Beijing:科學

33、出版社(Science Press,1996.27913Erikss on S,Glad G,Perne malm P A,et al.J.Chro matogr.,1986,359:26527414Maa Y,Horvath C.J.Chro matogr.,1988,445:718615Huber C G,Oefner P J,Bonn G K.J.Chromatogr.,1992,599:11311816Oefner P J,Underhill P A.Am.J.Hum.Genet.,1995,57(s uppl:A26617Kulin A,Munson K,Gjerde D,et al

34、.Gene tic Tes ti ng,1998,4:20120618Kulin A,Munson K,Taylor P,et al.Mol.Biotechnol.,1999,11:25726119Hou Y P,Meng H Y,Tang H,et al.International Congress Se-ries,2003,1239:S9S1420Huber C G,Pre mstaller A,Xiao W Z,e t al.J.Bi ochem.Bio-phys.Meth.,2001,47:51921Huber C G,Oefner P J,Bonn G K.Anal.Che m.,1

35、995,67:57858522Oberacher H,Huber C G.Trends in Analytical Chemi stry,2002,21:16617423Huber C G,Oefner P J,Bonn G K.Nucleic Acids Research,1993,21:1061106624Arnold N,Gros s E,Schwarz-Boeger U,et al.Hum.M utat.,1999,14:33333925Xiao W Z,Oefner P J.Human Mutation,2001,17:43947426Issaq H J,Xu H Y,Ki ng C

36、 C,et al.J.Chromatography B,2000,738:24324827Xiao W Z,Oefner P J.Human Mutation,2001,17:43947428藺麗(Lin L,方能虎(Fang N H,任吉存(Ren J C等.廣西師范大學學報自然科學版(J ournal of Guangxi Normal Univer-sity,2003,21(3:868729Fang N H,Lin L,Ren J C,et al.Biomedical Chromatography,2004,18(9:62562930Liu W G,Smith D I,Rechtzige

37、l K J,et al.Nucleic Aci d Re-search,1998,26:1396140031Unger K K,Janz en R,Jilge G.Chromatographia,1987,24:14415432Unger K K,Jilge G,Kinkel J N,et al.J.Chromatogr.,1986,359:617233Kirkland J J.Anal.Che m.,1992,64:1239124834Afeyan N B,G ordon N F,Maz saroff I,Varady L,et al.J.Chro-matogr.,1990,519:1293

38、5Hjerten S,Li Y M,Liao J L,et al.Nature,1992,356:81081136Svec F,Frechet J M.J.Anal.Chem.,1992,64:82082237Hjerten S,Liao J L,Zhang R.J.Chromatogr.,1989,473:27327538M i nakuchi H,Nakanishi K,Soga N,et al.Anal.Che m.,1996,68:3498350139Petro M,Svec F,Frechet J M J.J.Chromatogr.A,1996,752:596640Liapis A

39、I,M cCoy M A.J.Chromatogr.A,1994,660:859641Rodrigues A E,Lu Z P,Lourei ro J M,et al.J.Chromatogr.,1993,653:18919842Kosaki K,Yoshihas hi H,Ohas hi Y,et al.Biochem.Biophys.M e thods,2001,47:11111943Si nger V L,Jones L J,Yue S T,et al.Anal.Bi ochem.,1997,249:228238#347#第2期方能虎等變性高效液相色譜一種新的基因突變檢測方法# 348

40、# 44 45 46 47 48 49 50 51 52 化 學 進 70 展 第 17 卷 Darzynkiewicz Z, Traganos F, Carter S P, et al . Exp. Cell Res. , 1987, 172: 168 179 LePecq J B, Paolett i C A. J . M ol. Biol . , 1967, 27: 87 106 Cosa G , Focsaneanu K S, McLean J R, et al. Photochem. Photo biol. , 2001, 73: 585 599 Bahrami A R, D ick

41、man M J, Mat in M M , et al. Analytical Bio chemistry, 2002, 309: 248 252 Hecker K H, Taylor P D, Gjered D T. Anal. Biochem. , 1999, 272: 156 164 http: Pwww. transgenomic. com. cn Pdf P P Nordhoff E, K irpekar F, Roepstorff P. Mass Spect rum. Rev. , 1996, 15: 76 138 Portier N , van Dorsselaer A, Cor

42、dier Y, et al. Nucleic A cids Res. , 1994, 22: 3895 3903 蘇智廣( Su Z G , 張思仲( Zhang S Z , 侯一平( Hou Y P 等. 中華醫(yī) 學遺 傳學 雜志 ( Chinese Journal of Medical Genet ics , 2000, 17: 157 160 Wagner T M, Hirt enlehner K , Shen P, et al. Hum. Mol. Gen et. , 1999, 8: 413 433 71 72 Wagner T M, Moslinger R A, Muhr D, e

43、t al . Int. J. Cancer, 1998, 77: 354 360 Gross E, Arnold N , Pfeifer K , et al . Human Mut ation, 2000, 16: 345 353 73 K iechle M , Gross E, Schwarz Boeger U , et al. Human Mutat ion Mutation in Brief # 379 ( 2000 Online. ( http: Pwww. trans P genomic. com. cn PdfP P Kiechle% 20et% 20al% 2000% 20( 1

44、45 . pdf 74 Oldenburg J, Ivaskevicius V, Rost S, et al. J. Biochem. Bio phys. Methods, 2001, 47: 39 51 75 76 Holinsk- Feder E, Weiss M, Brandau O, et al. Pediatrics, 1998, i 101: 276 284 Boutin P, Vasseur F, Samson C, et al . Diabetologia, 2001, 44: 775 778 77 Bennett R R , Dunnen J, OcBrien K F, et

45、 al . BMC G enet . , 2001, 2: 17. ht tp: P www . biomedcent ral . com 1471 2156 2P P P P 17 53 施錦繡( Shi J X , 楊爽( Yang S , 姜正文( Jiang Z W 等. 中 華醫(yī) 學 遺 傳學 雜 志 ( Chinese Journal of Medical Genet ics , 2001, 18( 3 : 198 201 78 79 Lam C W, Li C K, Lai C K , et al. M olecular Genetics and Me t abolism, 20

46、02, 75: 91 95 Santer R, Rischewski J, Block G, et al. Human Mutation M uta t ion in Brief # 348 ( 2000 Online. http: Pwww. transgenomi c. P com. cnP Santer% 20et %20al% 2000% 20( 116 . pdf pdfP 54 55 56 57 58 Eva G, Marion K, Norbert A. J. Biochem. Biophy. M ethods, 2001, 47: 73 81 Rischewski J, Sch

47、neppenheim R . J. Biochem. Biophy. M ethods, 2001, 47: 53 64 Skopek T R , Glaab W E, Monroe J J, et al. Mutation Research, 1999, 430: 13 21 Bardw ell P D, Martin A, Scharff M D. Journal of Immunological Methods, 2002, 266: 165 173 Robert s P S, Jozw iak S , Kwiatkowski D J, et al . J. Biochem. Bioph

48、ys. M ethods, 2001, 47: 33 37 81 80 許二赫( Xu E H , 賈建平( Jia J P , 孫文君( Sun W J 等. 中 國神經(jīng)免疫學和神經(jīng) 病學雜志 ( Chinese Journal of Neuroim munology and N eurology , 2003, 10( 1 : 1 5 Rossett i S, Chauveau D, Walker D, et al. Kidney. Int . , 2002, 61: 581 588 靳斌( Jin B , 任軍( Ren J , 張亮( Zhang L 等. 第四 軍醫(yī)大 學學報( Jo

49、urnal of the Fourt h Mil itary Medical U niversity , 2003, 24( 10 : 911 913 郝磊( Hao L , 戚豫( Q i Y . 中 國優(yōu)生 與遺傳 雜志 ( Chinese Journal of Birth Health & Heredity , 2003, 11( 3 : 30 32 Desai P P, Bunker C H, Flora A M, et al. Atherosclerosis, 2002, 163: 329 338 59 60 61 62 63 64 Choy Y , Dabora S, Ha

50、ll F, et al. Ann. Hum. G enet . , 1999, 63: 383 391 Anotonarakis E S, Sampson J R, Cheadle J P. J. Biochem. Bio phys. M ethods, 2002, 51: 161 164 Liu W O, Oefner P J, Qian C, et al. Genet . Test. , 1997, 1: 237 242 OcDonovan M C, Ofener P J, Robert s S C, et al . Genomics, 1998, 52: 44 49 Dobson -St

51、one C, Cox R D, Lonie L, et al. Eur. J. Hum. Gen et . , 2000, 8: 24 32 Webster M T, Spencer W R, Clegg J B. Mut ation Research Fun P damental and Molecular M echanisms of Mutagenesis, 2002, 501: 99 103 82 83 84 85 Pitarque M, von Richter O, Oke B, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2001, 284: 4

52、55 460 86 87 Flex E, de Luca A , D. Apice M R, et al. Neuromuscular Disor ders, 2002 12: 501 505 M ellai M , Giordano M , DcAlfonso S, et al. Human Immunology, 2003, 64: 274 284 65 66 67 68 Colosimo A , Guida V , de Luca A, et al. Human Mutat ion, 2002, 19: 287 295 Holinsk- Feder E, Muller Koch Y, Friedl W, et al . J. Biochem. i Biophys. M ethods, 2001, 47: 21 32 Kurzawski G, Safranow K , Suchy J, et al. J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51: 89 100 Underhill P A, Jin L, Lin A A, et al. Genome Res. , 1997, 7: 996 1005 88 89 Conte I, Lestingi M , den Hollander A ,