食品微生物檢驗用樣品抽樣方法及應(yīng)用3.21課件

1、 食品微生物檢驗用樣品的抽樣方法及應(yīng)用 品質(zhì)研發(fā)部 食品抽樣檢測的概念和目的食品抽樣檢測的概念和目的食品抽樣檢測的意義食品抽樣檢測的意義我國及國際食品和飼料微生物抽樣依據(jù)我國及國際食品和飼料微生物抽樣依據(jù)抽樣方案（二級、三級計數(shù)抽樣方案流程）抽樣方案（二級、三級計數(shù)抽樣方案流程）微生物檢驗抽樣、制樣操作原則微生物檢驗抽樣、制樣操作原則生產(chǎn)和加工環(huán)境的微生物采樣生產(chǎn)和加工環(huán)境的微生物采樣空氣采樣與測試方法空氣采樣與測試方法-沉降法沉降法 食品抽樣檢測的概念和目的食品抽樣檢測的概念和目的（可接收性抽樣： 從某批中選擇一個或多個樣品進行檢驗,根據(jù)樣品檢驗結(jié)果對該批予以接受或者不接受。） ! 如果樣品

2、的采取、運送、保存或制備過程中操作不當(dāng)，或者樣品不具有代表性，就會使實驗室的微生物檢驗結(jié)果毫無意義。!微生物檢驗采樣的核心要求： 1 保證樣品的和 2 保證整個微生物檢驗過程在條件下完成 食品抽樣檢測的意義食品抽樣檢測的意義1. 及時掌握食品及原料的過程衛(wèi)生狀況（食品采購、生產(chǎn)加工、儲存運輸、銷售消費等）2. 評價食品衛(wèi)生質(zhì)量3. 用于尋找及分析問題，制定和實施控制措施!抽樣檢測足夠量的樣品以獲得同一批次產(chǎn)品的有意義的信息。抽樣檢測足夠量的樣品以獲得同一批次產(chǎn)品的有意義的信息。!一個合理的抽樣計劃并不能保證健康危害完全不發(fā)生。一個合理的抽樣計劃并不能保證健康危害完全不發(fā)生。 抽樣檢驗的局限抽樣

3、檢驗的局限 我國食品和飼料微生物抽樣依據(jù)我國食品和飼料微生物抽樣依據(jù)!國家標(biāo)準(zhǔn)（GB,GB/T）!農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（綠色食品，無公害食品等）（NY，NY/T）!檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN，SN/T）!地方標(biāo)準(zhǔn)（DB） 國際食品和飼料微生物抽樣依據(jù)國際食品和飼料微生物抽樣依據(jù)!國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會 (International Committee on Microbiological Specification for Foods, ICMSF) （ ICMSF方法是從統(tǒng)計學(xué)角度來考慮，對一批產(chǎn)品檢查多少個檢樣才能夠有代表性，才能客觀地反映該批產(chǎn)品質(zhì)量的設(shè)想采樣的。）! 美

4、國食品藥品管理局(USA FDA)! 美國農(nóng)業(yè)部(USDA)! 歐盟委員會法令(EC)! 新西蘭食品安全局(NZFSA)! 澳大利亞檢驗檢疫局(AQIS) 抽樣方案抽樣方案!抽樣方案不是孤立存在的，它應(yīng)與產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和方法標(biāo)準(zhǔn)等充分銜接，才能更有效。衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)抽樣方案抽樣方案檢驗方法檢驗方法食品安全目標(biāo)食品安全目標(biāo)FSO !ICMSF的采樣方案的采樣方案:!ICMSF方法中包括二級法及三級法方法中包括二級法及三級法2種。二級法只設(shè)有種。二級法只設(shè)有n、c及及m值，三級法則有值，三級法則有n、c、m及及M值。值。 !n：指一批產(chǎn)品的采樣個數(shù)。：指一批產(chǎn)品的采樣個數(shù)。!c：指該批產(chǎn)品中檢樣菌

5、數(shù)超過限量的檢樣個數(shù)。：指該批產(chǎn)品中檢樣菌數(shù)超過限量的檢樣個數(shù)。!m：指合格菌數(shù)限量。：指合格菌數(shù)限量。!M：指附加條件后判定為合格的菌數(shù)限量：指附加條件后判定為合格的菌數(shù)限量 。!在中等或嚴重危害的情況下使用二級抽樣方案，對健在中等或嚴重危害的情況下使用二級抽樣方案，對健康危害低的則建議使用三級抽樣方案?？滴：Φ偷膭t建議使用三級抽樣方案。 !ICMSF提出的采樣基本原則，是根據(jù)以下考慮來規(guī)定提出的采樣基本原則，是根據(jù)以下考慮來規(guī)定不同的采樣數(shù)不同的采樣數(shù): !(1) 各種微生物本身對人的危害程度各有不同；各種微生物本身對人的危害程度各有不同；!(2) 食品經(jīng)不同條件處理后，其危害程度可分為食

6、品經(jīng)不同條件處理后，其危害程度可分為3種情種情況：危害度降低；危害度未變；危害度增加。況：危害度降低；危害度未變；危害度增加。!ICMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理條件是將微生物的危害度、食品的特性及處理條件三者綜合在一起進行食品中微生物危害度分類的三者綜合在一起進行食品中微生物危害度分類的 。這。這個設(shè)想是很科學(xué)的，符合實際情況的，對生產(chǎn)廠及消個設(shè)想是很科學(xué)的，符合實際情況的，對生產(chǎn)廠及消費者來說都是比較合理的。費者來說都是比較合理的。 抽樣方案的選擇抽樣方案的選擇!廣泛分布于食品中，具有嚴重危害或者中度健康危害的微生物（病原菌），如沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸埃希氏菌、肉毒梭菌

7、、單核細胞增生李斯特菌等 執(zhí)行二級計數(shù)抽樣方案（+/-）!沒有或者具低度危害的微生物（衛(wèi)生指標(biāo)菌），或者具有中度危害（擴散限制）的微生物，如需氧微生物、嗜冷微生物、乳酸菌、酵母菌、霉菌（產(chǎn)犢霉菌除外）、大腸菌群、耐熱大腸菌群等 執(zhí)行三級計數(shù)抽樣方案（數(shù)值和濃度）（數(shù)值和濃度） 主要采用二級取樣方案：中國、以色列、日本、美國、南非、古巴等 。 主要采用三級取樣方案：中國、智利、新西蘭、歐洲委員會、加拿大、芬蘭、丹麥、法國、澳大利亞等。 從標(biāo)準(zhǔn)的嚴格程度看，二級取樣方案比三級取樣方案要求更嚴格。二級取樣方案的合格判定標(biāo)準(zhǔn)只有“是”和“否”，沒有中間帶，而三級取樣方案則有中間帶，相對寬松，這也表明三

8、級取樣方案更注重各種微生物本身對人的危害程度，從風(fēng)險評估的角度看，也更科學(xué)一些。從標(biāo)準(zhǔn)的制定來看，三級取樣方案判定合格標(biāo)準(zhǔn)的制定更需建立在科學(xué)評估的基礎(chǔ)上，手續(xù)更加繁瑣，而且在實際應(yīng)用中操作較復(fù)雜；而二級取樣方案在實際操作中則相對簡單。 二級計數(shù)抽樣方案流程二級計數(shù)抽樣方案流程 目標(biāo)微生物以檢出目標(biāo)微生物以檢出/未檢出（未檢出（+/-）為指標(biāo)：）為指標(biāo)： 設(shè)定設(shè)定m值、值、n值和值和c值值 抽取抽取n個子樣，組成試驗樣品個子樣，組成試驗樣品 檢驗每個子樣檢驗每個子樣 所有樣品的檢驗結(jié)果所有樣品的檢驗結(jié)果m,或或 c個樣品的檢驗結(jié)個樣品的檢驗結(jié) 果果 m，接收該批次，接收該批次 c個樣品的檢驗結(jié)

9、果個樣品的檢驗結(jié)果m，拒絕接收該批次，拒絕接收該批次 !二級法：二級法：!只設(shè)定合格判定標(biāo)準(zhǔn)只設(shè)定合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過值，超過m值的，則為不合格品。值的，則為不合格品。通過檢查在檢樣中是否有超過通過檢查在檢樣中是否有超過m值的，來判定該批是值的，來判定該批是否合格。否合格。 !如生食魚片中細菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為如生食魚片中細菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=0，m=100cfu / g。其中。其中m=100cfu / g即為限量標(biāo)準(zhǔn)，即為限量標(biāo)準(zhǔn)，n=5即取樣即取樣5個，個，c=0即表示在該批即表示在該批5個檢樣中，若未見有超過個檢樣中，若未見有超過m值為值為100cfu / g的檢樣，則該批產(chǎn)品為合格品。的

10、檢樣，則該批產(chǎn)品為合格品。!cfu：colony forming unit, 菌落形成單位菌落形成單位舉例舉例 三級計數(shù)抽樣方案流程三級計數(shù)抽樣方案流程 目標(biāo)微生物以計數(shù)為指標(biāo)：目標(biāo)微生物以計數(shù)為指標(biāo)： 設(shè)定設(shè)定m值、值、M值、值、n值和值和c值值 抽取抽取n個子樣，組成試驗樣品個子樣，組成試驗樣品 檢驗每個子樣檢驗每個子樣 所有樣品的檢驗結(jié)果所有樣品的檢驗結(jié)果 m，或，或c個樣品的檢驗結(jié)果介于個樣品的檢驗結(jié)果介于 m和和M之間；接收該之間；接收該批次批次 c個樣品的檢驗結(jié)果介于個樣品的檢驗結(jié)果介于m和和M之間，或所有樣品的檢驗結(jié)果之間，或所有樣品的檢驗結(jié)果M；拒絕接收；拒絕接收該批次該批次

11、!三級法：三級法：!設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)值設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)值m及及M值，如同二級法，超過值，如同二級法，超過m值的值的檢樣為該檢樣不合格。所有檢樣均小于檢樣為該檢樣不合格。所有檢樣均小于m值，該批產(chǎn)值，該批產(chǎn)品為合格；在品為合格；在m值到值到M值范圍內(nèi)的檢樣數(shù)在值范圍內(nèi)的檢樣數(shù)在c值范圍內(nèi)，值范圍內(nèi)，即為附加條件合格，否則為不合格；凡有檢樣超過即為附加條件合格，否則為不合格；凡有檢樣超過M值者，則該批產(chǎn)品為不合格。值者，則該批產(chǎn)品為不合格。!如澳大利亞冷凍糖制食品的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)為如澳大利亞冷凍糖制食品的大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=2，m=100，M=1000，其含義是從一批產(chǎn)品中，取，其含義是從一批產(chǎn)品

12、中，取5個檢個檢樣，若所有檢樣大腸菌群結(jié)果均小于樣，若所有檢樣大腸菌群結(jié)果均小于m=100，則判定，則判定為該批產(chǎn)品合格；若為該批產(chǎn)品合格；若2個檢樣的結(jié)果位于個檢樣的結(jié)果位于m與與M值之值之間間(即即1001000之間之間)，則判定為附加條件合格；若有，則判定為附加條件合格；若有3個及以上檢樣的結(jié)果位于個及以上檢樣的結(jié)果位于m與與M值之間，判定為該批產(chǎn)值之間，判定為該批產(chǎn)品不合格；若有任一檢樣大腸菌群數(shù)超過品不合格；若有任一檢樣大腸菌群數(shù)超過M值值(即即1000)者，則判定該批產(chǎn)品不合格。者，則判定該批產(chǎn)品不合格。舉例舉例 涉及健康危害水平的抽樣涉及健康危害水平的抽樣方案及其應(yīng)用條件方案及其

13、應(yīng)用條件ICMSF危害類型危害類型目標(biāo)微生物實例目標(biāo)微生物實例抽樣后食品被處置和消費的條件抽樣后食品被處置和消費的條件降低危害降低危害危害無變化危害無變化增加危害增加危害無直接健康危害無直接健康危害菌落總數(shù)菌落總數(shù)三級法，三級法，n=5,c=3n=5,c=3三級法，三級法，n=5,c=2n=5,c=2三級法，三級法，n=5,c=1n=5,c=1輕度間接危害（指示菌）輕度間接危害（指示菌） 大腸菌群、大腸桿菌、大腸菌群、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌三級法，三級法，n=5,c=3n=5,c=3三級法，三級法，n=5,c=2n=5,c=2三級法，三級法，n=5,c=1n=5,c=1中度危害

14、，有限的擴散中度危害，有限的擴散金黃色葡萄球菌、蠟樣金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌菌三級法，三級法，n=5,c=2n=5,c=2三級法，三級法，n=5,c=1n=5,c=1三級法，三級法，n=10,c=1n=10,c=1重度危害，通常不威脅重度危害，通常不威脅生命，后遺癥少見，病生命，后遺癥少見，病程中等程中等沙門氏菌、副溶血性弧沙門氏菌、副溶血性弧菌、致病性大腸桿菌菌、致病性大腸桿菌二級法，二級法，n=5,c=0n=5,c=0二級法，二級法，n=10,c=0n=10,c=0二級法，二級法，n=20,c=0n=20,c=0極重度危害，對一般人極重度危害，對一般人

15、群或特定人群危脅生命群或特定人群危脅生命或?qū)е潞筮z癥或病程較或?qū)е潞筮z癥或病程較長長肉毒梭菌、霍亂弧菌、肉毒梭菌、霍亂弧菌、傷寒沙門氏菌、副傷寒傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌沙門氏菌二級法，二級法，n=15,c=0n=15,c=0二級法，二級法，n=30,c=0n=30,c=0二級法，二級法，n=60,c=0n=60,c=0 舉例舉例1!巴氏滅菌的液態(tài)、冷凍、干燥雞蛋制品的抽樣方案巴氏滅菌的液態(tài)、冷凍、干燥雞蛋制品的抽樣方案（ICSMF，1986）目標(biāo)微生物目標(biāo)微生物抽樣方案抽樣方案n nc c限量（限量（g g-1-1）m mM M需氧菌落計數(shù)需氧菌落計數(shù)3 35 52 25 510104 4

16、10106 6大腸菌群大腸菌群3 35 52 2101010103 3沙門氏菌（常規(guī)沙門氏菌（常規(guī)檢驗）檢驗）2 25 50 00 0- -2 210100 00 0- -2 220200 00 0- -沙門氏菌（針對沙門氏菌（針對高危人群）高危人群）2 215150 00 0- -2 230300 00 0- -2 260600 00 0- - !GB2749-2003蛋制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 采用二級和三級取樣方案的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)采用二級和三級取樣方案的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)2010!GB5420干酪!GB11674乳清粉和乳清蛋白粉!GB19302發(fā)酵乳!GB19644乳粉!GB19645巴氏殺菌乳!

17、GB25191調(diào)制乳!GB25192再制干酪!GB13102煉乳!GB 19646稀奶油、奶油和無水奶油2010-12-01實施!GB10765嬰兒配方食品!GB10767較大嬰幼兒和幼兒配方食品!GB10769嬰兒谷物類輔助食品2011-04-11實施!（GB19301生乳2010-06-01實施，未采用二級或三級取樣方案） GB4789.1-2010 食品微生物學(xué)檢驗食品微生物學(xué)檢驗 總則總則4.2 采樣方案4.2.1類型 采樣方案分為二級和三級采樣方案。二級采樣方案設(shè)有n、c和m值，三級采樣方案設(shè)有n、c、m和 M值。 n：同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)； c：最大可允許超出m值的樣品數(shù)；

18、 m：微生物指標(biāo)可接受水平的限量值； M： 微生物指標(biāo)的最高安全限量值。 注1： 按照二級采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個樣品中，允許有c個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值大于m值。 注2： 按照三級采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個樣品中，允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值小于或等于m值；允 許有c個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值在m值和M值之間；不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值大于M值。 GB4789.1-2010 例如：n=5，c=2，m=100 CFU/g，M=1 000 CFU/g。含義是從一批產(chǎn)品中采集5個樣品，若5個樣品的檢驗結(jié)果均小于或等于m值（100 CFU/g），則這種情況是允許的；若2個樣品的結(jié)

19、果（X）位于 m值和M值之間（100 CFU/g 1 000 CFU/g）， 則這種情況也是不允許的。 4.2.2 各類食品的采樣方案 按相應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定執(zhí)行。 制樣的一般要求制樣的一般要求!全部制備過程應(yīng)為無菌操作!冷凍樣品應(yīng)在規(guī)定溫度和時間下緩化!制樣應(yīng)充分均勻： 液體樣品振搖混勻；粉末狀的邊取邊混；固體樣品應(yīng)從不同部位取樣，兼顧表面和深度?？s分干燥的顆粒狀及粉末狀樣品，最好使用圓錐四分法。圓錐四分法是把樣品充分混合后堆砌成圓錐體，再把圓錐體壓成扁平的圓形，中心劃兩條垂直交叉的直線，分成對稱的四等份，棄去對角的兩個四分之一圓，再混合，反復(fù)用四分法縮分，直到留下合適的數(shù)量作為“檢驗樣品”

20、。!取好的樣品應(yīng)以適宜方式與稀釋液充分混勻!盡量去除產(chǎn)品中可能存在的影響微生物指標(biāo)檢測的因素 !對取樣工具和一些試劑材料應(yīng)提前準(zhǔn)備、滅菌對取樣工具和一些試劑材料應(yīng)提前準(zhǔn)備、滅菌!開啟容器的工具：雙層紙包裹滅菌（121，15min）后，通?？稍诟稍餄崈舻沫h(huán)境中保存2個月。超過2個月后要重新滅菌。!樣品采集工具。!取樣容器：采用密封容器，最好不要使用玻璃容器，因為其在運輸途中易破碎而造成取樣失敗。!溫度計、標(biāo)記工具、防護用品等。 !樣品采集、運輸和貯存： 運輸工具的容量應(yīng)足以放下所取的樣品。采樣及運輸過程符合要求的時間和溫度，防止污染和變質(zhì)。!預(yù)處理、分析檢驗：適宜環(huán)境、正確的制樣和測試方法（依據(jù)

21、相應(yīng)的檢驗標(biāo)準(zhǔn)） 微生物檢驗抽、制樣操作原則微生物檢驗抽、制樣操作原則!防污染 防止抽樣、制樣及檢測的各個環(huán)節(jié)引入外源污染；或使樣品污染人員及環(huán)境。!均勻與合理 盡量了解目標(biāo)微生物在產(chǎn)品中的濃度和分布 ，兼顧檢樣的代表性代表性和偶然性。偶然性。 生產(chǎn)和加工環(huán)境的微生物采樣生產(chǎn)和加工環(huán)境的微生物采樣!“環(huán)境環(huán)境” 與產(chǎn)品接觸表面或其他可能存在的污染環(huán)節(jié)，如生產(chǎn)加工設(shè)備和材料、加工環(huán)境和操作人員。!衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SSOP)中的“食品接觸表面”!生產(chǎn)環(huán)境與環(huán)節(jié)中的間接接觸, “環(huán)境接觸表面”如空氣氣溶膠，地板，排水渠，墻壁，高架結(jié)構(gòu)，設(shè)備，圍裙，卡車或汽車輪子。 !此類采樣監(jiān)測一般不宜復(fù)檢，結(jié)果

22、適用于加工環(huán)境衛(wèi)生狀此類采樣監(jiān)測一般不宜復(fù)檢，結(jié)果適用于加工環(huán)境衛(wèi)生狀況的趨勢性分析、評估與控制。況的趨勢性分析、評估與控制。!對某一致病菌的環(huán)境監(jiān)測采樣同樣適用，需要參考致病菌對某一致病菌的環(huán)境監(jiān)測采樣同樣適用，需要參考致病菌檢測的具體方法要求。檢測的具體方法要求。 擦拭法原理擦拭法原理!選定一定范圍的產(chǎn)品接觸表面/環(huán)境，用干或濕的棉簽進行擦拭，然后將棉簽浸入滅菌稀釋液或中和液的容器中，混勻后進行檢測。 擦拭法擦拭法圖示 材料與器具材料與器具!樣品采集工具：單獨包裝的滅菌的棉簽、海綿、紗棉墊等。海綿和紗棉墊用于100cm2的表面采樣。取樣工具必須符合無菌要求。!取樣容器：滅菌的瓶或袋，試管及其他類似的密閉容器。最好不要使用玻璃容器。!消毒劑：75%酒精或其他有類似效果的食品級消毒劑食品級消毒劑。 !稀釋液：滅菌的緩沖蛋白胨水（0.1%，PH7.5）或含鹽蛋白胨水以及其他適當(dāng)?shù)南♂屢海ㄈ鏜肉湯、LB肉湯、D/E中和肉湯、腦心浸液肉湯等）。!標(biāo)記工具!樣品運輸工具：便攜式冰箱或保溫箱。使用保溫箱或替代容器（泡沫塑料箱）時，應(yīng)將足夠量的冷凍冰袋放在容器的四周，以保證運輸過程中樣品容器的溫度。!防護用品：經(jīng)消毒滅菌的工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。 操作步驟操作步驟 !棉簽采樣：棉簽采樣： (1)臺