長(zhǎng)期低硒、低碘對(duì)子代發(fā)育期大鼠甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)及PCNA表達(dá)的影響

1、長(zhǎng)期低硒、低碘對(duì)子代發(fā)育期大鼠甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)及PCNA表達(dá)的影響    【摘要】  目的：研究長(zhǎng)期低硒、低碘飼料喂養(yǎng)對(duì)子代發(fā)育期大鼠甲狀腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)以及PCNA表達(dá)的影響。方法：選取人工低硒、低碘飼料喂養(yǎng)繁殖的SD大鼠模型的仔3代胎鼠(F3E)、4日齡(F3P4)、21日齡(F3P21)、成年(F3A)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的甲狀腺石蠟標(biāo)本，常規(guī)切片，蘇木精_伊紅染色，免疫組化染色，鏡下觀察，濾泡計(jì)數(shù)。動(dòng)物模型分為對(duì)照組，低硒(Se-)組，低碘(I-)組和低硒、低碘(Se-I-)組，各組分別喂以不同硒、碘水平的人工配制飼料，繁衍至仔4代。取甲狀腺，制做石

2、蠟切片。結(jié)果：各發(fā)育期時(shí)間點(diǎn)I-組與Se-I-組甲狀腺體積增大，重量增加，濾泡增生，排列緊密。這種增生現(xiàn)象從胎鼠期間即有出現(xiàn)。在成年大鼠Se-組甲狀腺濾泡有壞死和纖維化。PCNA在Se-I-組與I-組均強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)百分比依次為成年Se-I-組50%，I-組28?6%。21d Se-I-組21?4%，I-組16?7%。結(jié)論：低碘和低硒、低碘均可致仔代發(fā)育期大鼠甲狀腺濾泡明顯增生。這種增生現(xiàn)象在胚胎期即表現(xiàn)。低硒能引起部分仔代大鼠甲狀腺濾泡的壞死與纖維化。 【關(guān)鍵詞】  大鼠 缺硒 缺碘 甲狀腺    AbstractObjective: To s

3、tudy the effects of longtime selenium(Se)and iodine(I)deficiency on histomorphology and PCNA expression of thyroid gland of rat at development stage. Methods: The paraffin specimens of thyroid gland of the third generation rats with the age of embryo(F3E), 4 days(F3P4), 21 days(F2P21), adult(F3A) as

4、 four time points of research subjects were chosen. The sections of paraffin specimens were hematoxylin_eosin stained and immunohistochemistry stained, and then observed under microscope. The follicles were counted under microscope. Healthy SD rats were divided into control group, Se_deficient group

5、(Se- group), I_deficient group(I-group) and both Se_and I_deficient group(Se- I- group). The rats in each group were given the artificial feeds containing different levels of Se and I. These rats were bred to the fourth generation. Results: At each research time points, the goiter was produced in I-

6、 group and Se-I- group and the thyroid weight and volume were increased between two groups. Under microscope, the features of small follicular proliferation were observed. The number and density of follicles were increased. The volume of follicles, the surface and the thyroid colloid of follicle cav

7、ity were decreased. These features were observed in I- group and Se-I- group of each time points. The follicular necrosis and fibrosis were observed in Se- group of adult rat. The strong expression of PCNA occurred in Se-I- group and Se- group, Se-I- group 50?0%, I- group 28?6% in adult, Se-I-21?4%,

8、 I-16?7% in 21_day. Conclusion: Simple selenium deficiency does not induce the thyroid follicular proliferation. Simple iodine deficiency and both selenium and iodine deficiency greatly induce the thyroid follicular proliferation.    Key Wordsrat; selenium deficiency; iodine deficienc

9、y; thyroid gland    硒、碘是人體發(fā)育所必須的微量元素1。適量碘攝入是維持甲狀腺正常形態(tài)與功能的重要條件。硒通過(guò)硒蛋白參與甲狀腺素的代謝及甲狀腺的抗氧化過(guò)程25。以往的硒、碘缺乏對(duì)甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響多以原代的成年動(dòng)物模型為研究對(duì)象6,7。而對(duì)長(zhǎng)期硒、碘缺乏動(dòng)物其仔代的甲狀腺研究卻少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了長(zhǎng)期低硒、低碘喂養(yǎng)的第3代大鼠不同發(fā)育日齡甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變以及增生情況，以探討低硒、低碘對(duì)仔代發(fā)育期大鼠甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。    1 材料與方法    1?1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及樣品制備

10、選取本課題組前期成功建立的人工低硒、低碘飼料喂養(yǎng)繁殖的SD大鼠模型仔3代胎鼠(F3E)、4日齡(F3P4)、21日齡(F3P21)、成年(F3A)4個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的大鼠為研究對(duì)象。以健康斷乳后封閉群SD大鼠為原代(F0)，每組雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組硒(0?10?3)g/g，碘0?2g/g，低硒(Se-)組硒0?02g/g，碘0?2g/g，低碘(I-)組硒(0?10?3)g/g，碘0?04g/g，低硒、低碘(Se-I-)組硒(0?010?02)g/g，碘0?04g/g，并分別喂以不同硒、碘水平的人工配制飼料。硒以亞硒酸鈉溶液，碘以碘酸鉀溶液按上述劑量加入人工配制的固體飼料。大鼠自由進(jìn)食，飲用去離

11、子純凈水。每代大鼠發(fā)育至34月齡時(shí)開(kāi)始交配，母鼠懷孕期、哺乳期飼料水平維持不變，仔鼠由母鼠哺育至21d斷奶，連續(xù)繁衍至仔4代。在不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)各組大鼠斷頭處死，沿氣管找到甲狀腺，迅速取出置入體積分?jǐn)?shù)10%的中性福爾馬林溶液內(nèi)固定，常規(guī)脫水，浸蠟，包埋，并連續(xù)切片(厚0?5m)。    1?2 蘇木精_伊紅染色、組織學(xué)觀察及濾泡計(jì)數(shù)切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，蘇木精染色5min，水洗片刻，鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗10min，飽和碳酸鋰溶液數(shù)秒，水洗10min。伊紅染液10s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察。在成年、21d、4d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的

12、每一實(shí)驗(yàn)組內(nèi)選取5個(gè)標(biāo)本，利用Qwin4?0圖像分析系統(tǒng)(Leica公司，德國(guó))每一標(biāo)本選取5個(gè)200倍鏡下視野進(jìn)行濾泡計(jì)數(shù)，求出平均值。    1?3免疫組化染色及結(jié)果判斷切片常規(guī)脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2室溫孵育10min。PBS洗5min共3次。微波修復(fù)抗原20min，室溫冷卻30min。PBS洗5min共3次。加入稀釋的PCNA單克隆一抗(上海長(zhǎng)島生物公司，中國(guó)，編號(hào)M_0437)，4冰箱過(guò)夜。室溫平衡5min，PBS洗3min共3次。滴加二抗，37恒溫30min。PBS洗5min共3次。DAB顯色，脫水，透明，封固。PCNA陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞為細(xì)胞核著色

13、，應(yīng)用IM50圖像采集系統(tǒng)(Leica公司，德國(guó))每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為()，陽(yáng)性細(xì)胞比率25為()， 2550為()， 5075%為()，>75%為()。    1?4  主要儀器與試劑Reichert_Jung 820石蠟切片機(jī)、DMRXA2全能顯微鏡、Qwin 4?0圖像分析系統(tǒng)、IM50圖像采集系統(tǒng)(Leica公司，德國(guó))。CH_2顯微鏡(Olympus公司，日本)。PCNA單克隆_抗體；HRP標(biāo)記的兩步法抗小鼠、抗兔檢測(cè)試劑(上海長(zhǎng)島生物公司代理，Antibody Diagnositica公司

14、，美國(guó)，編號(hào)D_3004)。DAB底物試劑(上海長(zhǎng)島生物公司，中國(guó)，編號(hào)FL_6001)。    1?5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11?5統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用單因素方差分析以及卡方檢驗(yàn)。       2 結(jié)果    2?1 甲狀腺組織學(xué)觀察不同硒、碘水平喂養(yǎng)的大鼠甲狀腺可有不同改變。F3A：成年對(duì)照組甲狀腺濾泡大小不等，周邊濾泡較中央的大，腔內(nèi)膠質(zhì)豐富，濾泡上皮細(xì)胞呈矮立方狀，部分周邊濾泡上皮細(xì)胞扁平。與對(duì)照組比，Se-組鏡下形態(tài)變化不明顯，但部分標(biāo)本有濾泡壞死纖維化的改變；I-組鏡

15、下見(jiàn)濾泡增多，體積小，排列密集，濾泡腔小，腔內(nèi)膠質(zhì)稀薄有空泡。濾泡上皮細(xì)胞呈單層立方狀或柱狀。濾泡間有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集。Se-I-組濾泡數(shù)量多，排列密集，濾泡腔小，甚至無(wú)腔而呈一細(xì)胞團(tuán)，腔內(nèi)膠質(zhì)稀薄有空泡。濾泡上皮細(xì)胞呈立方或柱狀。F3P21：21日齡的大鼠各組甲狀腺鏡下形態(tài)與成年組無(wú)太大差別。對(duì)照組與Se-組相似：濾泡大小不一，周邊大，中間小，膠質(zhì)豐富，濾泡上皮細(xì)胞呈矮立方或扁平狀。Se-組無(wú)濾泡壞死和纖維化。I-組出現(xiàn)小濾泡增生改變，濾泡體積小，數(shù)量多，排列緊密，濾泡腔小，腔內(nèi)膠質(zhì)稀薄，濾泡上皮細(xì)胞呈立方或柱狀。Se-I-組同樣出現(xiàn)明顯的小濾泡增生改變，濾泡小，數(shù)量多，膠質(zhì)稀薄，濾泡腔小

16、甚至無(wú)腔，呈一細(xì)胞團(tuán)。濾泡上皮細(xì)胞呈立方至高柱狀。F3P4：4日齡大鼠甲狀腺總體呈幼稚狀態(tài)，濾泡體積相對(duì)成年與21日齡小，對(duì)照組甲狀腺大濾泡少見(jiàn)，膠質(zhì)豐富，濾泡上皮細(xì)胞多呈矮立方狀。Se-組與對(duì)照組相似。I-組與Se-I-組甲狀腺濾泡同樣呈增生狀態(tài)，數(shù)量增多，體積縮小，排列緊密，濾泡腔小，有的還未形成濾泡而僅成一細(xì)胞團(tuán)。F3E：胎鼠對(duì)照組甲狀腺與其他日齡對(duì)照組相比呈明顯幼稚狀態(tài)，細(xì)胞密集，典型的濾泡少見(jiàn)，多數(shù)為腔小或未成腔的細(xì)胞團(tuán)，已成腔的濾泡內(nèi)膠質(zhì)稀薄。濾泡細(xì)胞多呈立方狀，濾泡間質(zhì)豐富。I-組與對(duì)照組比細(xì)胞密度增大，典型的濾泡少見(jiàn)，細(xì)胞團(tuán)增多，排列緊密。Se-組和Se-I-組胎鼠甲狀腺形成的

17、典型濾泡多于對(duì)照組與I-組，但仍然是小腔濾泡，膠質(zhì)稀薄。濾泡上皮細(xì)胞呈立方狀。而Se-I-組的濾泡數(shù)量明顯多于Se-組，排列緊密，腔小甚至無(wú)腔，細(xì)胞聚集呈團(tuán)，或僅出現(xiàn)小腔隙。總體來(lái)看，I-組和Se-I-組甲狀腺有明顯的增生現(xiàn)象，而Se-組和Se-I-組甲狀腺濾泡發(fā)育則更明顯。    2?2濾泡計(jì)數(shù)結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，I-組與Se-I-組濾泡計(jì)數(shù)均大于相應(yīng)對(duì)照組與Se-組(P<0?05)，Se-組與對(duì)照組及I-組與Se-I-組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0?05)，但亦表現(xiàn)出Se-組大于對(duì)照組的趨勢(shì)(表1)。 表1 濾泡計(jì)數(shù)結(jié)果   

18、   2?3 PCNA表達(dá)情況F3A組PCNA表達(dá)情況見(jiàn)表2,其中各組的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+)百分比分別為Se-I-組50?0，I-組28?6，Se-組6?25，對(duì)照組0?0，而Se-I-組明顯高于I-組。 表2 成年大鼠甲狀腺上皮PCNA表達(dá)情況P0?01F3P21組PCNA表達(dá)情況見(jiàn)表3，各組強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+)百分比分別為Se-I-組21?4，I-組16?7，Se-組0?0，對(duì)照組0?0，而Se-I-組明顯高于I-組。 表3 21d大鼠甲狀腺上皮PCNA表達(dá)情況    3  討論    甲狀腺增生腫大是碘缺乏

19、病的重要病理改變之一，單純碘缺乏導(dǎo)致甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化已在人和動(dòng)物體內(nèi)得以證實(shí)813。研究證明缺硒在碘缺乏病中有一定的協(xié)同作用，硒缺乏影響甲狀腺素的代謝，減少四碘甲狀腺原氨酸(T4)向三碘甲狀腺原氨酸(T3)的轉(zhuǎn)化。本課題組前期研究表明低硒對(duì)仔3代大鼠甲狀腺素代謝的影響更明顯，這說(shuō)明低硒在仔3代對(duì)甲狀腺素的代謝起主要影響作用13。硒又是多種抗過(guò)氧化物酶活性中心的重要組成部分，硒缺乏導(dǎo)致甲狀腺特別是濾泡上皮細(xì)胞上的多種抗過(guò)氧化物酶(如GPx、TrR等)表達(dá)減少，活性降低，造成甲狀腺抗過(guò)氧化能力下降，從而加重甲狀腺的損傷25。流行病學(xué)調(diào)查顯示環(huán)境缺碘地區(qū)往往伴有缺硒，硒、碘缺乏地區(qū)的人口世代繁衍

20、生息在低硒、低碘的環(huán)境里14,15。有研究，低硒、低碘對(duì)動(dòng)物模型甲狀腺的影響，但多以原代的成年動(dòng)物為研究對(duì)象6,7，低硒、低碘同時(shí)作用對(duì)仔代甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響鮮有報(bào)道。本文對(duì)模擬長(zhǎng)期低硒、低碘環(huán)境而建立起來(lái)的繁衍至4代的SD大鼠模型的第3代進(jìn)行研究13，觀察長(zhǎng)期低硒、低碘飼料喂養(yǎng)的仔3代4個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的大鼠甲狀腺形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及細(xì)胞增殖的情況。PCNA是常用于檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的指標(biāo)，有學(xué)者將其應(yīng)用于高碘甲狀腺腫的研究，很好地反映了濾泡上皮的增殖情況16。為探討低硒能否引起或加重甲狀腺的增生改變，檢測(cè)PCNA在低硒、低碘大鼠發(fā)育期甲狀腺的表達(dá)，以觀察濾泡上皮增殖的情況。本研究顯示，對(duì)照組甲狀腺周

21、邊濾泡較中央大，這是大鼠甲狀腺的正常表現(xiàn)17。相對(duì)于正常大鼠甲狀腺，I-組與Se-I-組甲狀腺在仔3代胚胎時(shí)期即有增生現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞密度增大，而到4d后則表現(xiàn)為濾泡數(shù)量增多，這種改變一直保持到成年。而Se-組在各個(gè)日齡內(nèi)卻無(wú)明顯濾泡增生現(xiàn)象。這些觀察結(jié)果提示，單純的低碘能夠?qū)е旅黠@的甲狀腺濾泡增生，與報(bào)道一致12。雖然在組織學(xué)觀察中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)低硒加重濾泡的增生改變，在濾泡計(jì)數(shù)方面，Se-組與對(duì)照組及Se-I-組與I-組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Se-組濾泡數(shù)量有大于對(duì)照組的趨勢(shì)。PCNA在成年和21d大鼠甲狀腺中表達(dá)也表現(xiàn)出Se-組的強(qiáng)陽(yáng)性多于對(duì)照組，Se-I-組的強(qiáng)陽(yáng)性多于I-組的趨勢(shì)。在成年Se

22、-組內(nèi)發(fā)現(xiàn)部分標(biāo)本有濾泡的壞死和纖維化，這與研究結(jié)果相似18。這些結(jié)果都預(yù)示著低硒對(duì)甲狀腺形態(tài)有一定影響。成年Se-組內(nèi)部分標(biāo)本濾泡的壞死和纖維化原因也許是低硒引起濾泡上皮細(xì)胞抗氧化能力下降，細(xì)胞遭到過(guò)氧化物的損傷所致。但這種現(xiàn)象沒(méi)有在其它日齡內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，推測(cè)可能是低硒對(duì)甲狀腺的破壞在成年期才出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)上的改變。本研究還發(fā)現(xiàn)在胚胎時(shí)期Se-組和Se-I-組甲狀腺濾泡的發(fā)育比非低硒組成熟一些，這一形態(tài)改變似乎預(yù)示著低硒因素在胚胎時(shí)期可促進(jìn)濾泡的發(fā)育，而其具體機(jī)制以及這種促進(jìn)作用利弊與否還有待于進(jìn)一步研究。 【參考文獻(xiàn)】  1Schwaiz K, Foltz CM. Facto

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