畢赤酵母表達系統(tǒng)資料整理

1、畢赤酵母表達系統(tǒng)Mut+和Muts畢赤酵母中有兩個基因編碼醇氧化酶AOX1及AOX2，細胞中大多數的醇氧化酶是AOX1基因產物，甲醇可緊密調節(jié)、誘導AOX1基因的高水平表達，較典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因調控分兩步：抑制/去抑制機制加誘導機制。簡單來說，在含葡萄糖的培養(yǎng)基中，即使加入誘導物甲醇轉錄仍受抑制。為此，用甲醇進行優(yōu)化誘導時，推薦在甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)。注意即使在甘油中生長(去抑制時，仍不足以使AOX1基因達到最低水平的表達，誘導物甲醇是AOX1基因可辨表達水平所必需的。AOX1基因已被分離，含AOX1啟動子的質?？捎脕泶龠M編碼外源蛋白的目的基因的表達。AOX2基因與AO

2、X1基因有97%的同源性，但在甲醇中帶AOX2基因的菌株比帶AOX1基因菌株慢得多，通過這種甲醇利用緩慢表型可分離Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖培養(yǎng)基中，不論是Mut+還是Muts其在對數期增殖一倍的時間大約為2h。Mut+和Muts菌株在沒有甲醇存在的情況下生長速率是一樣的，存在甲醇的情況下，Mut+在對數期增殖一倍的時間大約為4至6個小時，Muts在對數期增殖一倍的時間大約為18個小時。菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的區(qū)別 GS115、KM71和SMD1168等是用于表達外源蛋白的畢赤酵母受體菌，與釀酒酵母相比，畢赤酵母不會使蛋白過糖基化，糖基化后有利于

3、蛋白的溶解或形成正確的折疊結構。GS115、KM71、SMD1168在組氨酸脫氫酶位點(His4有突變，是組氨酸缺陷型，如果表達載體上攜帶有組氨酸基因，可補償宿主菌的組氨酸缺陷，因此可以在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選轉化子。這些受體菌自發(fā)突變?yōu)榻M氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型為Mut+，重組表達載體轉化GS115后，長出的轉化子可能是Mut+，也可能是Muts(載體取代AXO1基因，可以在MM和MD培養(yǎng)基上鑒定表型。SMD1168和GS115類似，但SMD1168基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶對外源蛋白的降解作用。其中X-33由于是野生型，因此耐受性

4、比較好，如果擔心轉化率的話可以考慮這種酵母菌，而X33與GS115一樣都是屬于MUT表現(xiàn)型，也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，但是據說會對外源基因表達有影響，KM71的親本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4有突變，在不含精氨酸的培養(yǎng)基中不能生長。用野生型 ARG4基因(約2kb插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密碼子及SalI(AOX1基因227/228密碼子位點，取代了AOX1基因16-227密碼子，此結構轉化至KM71親本菌(arg4his4中，分離產生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+轉化子遺傳分析顯示野生型AOX1被aox1:ARG

5、4結構所取代，所以KM71所有轉化子都是Muts表型。AOX1位點沒有被完全缺失，理論上可用你的目的結構通過基因取代方法替換aox1:ARG4結構，這樣重組菌株的表型是His+MutsArg-，這意味著重組菌株生長時需精氨酸。但僅添加精氨酸并不能完全緩和arg4突變的影響，arg4菌株在含精氨酸的最小培養(yǎng)基中不能很好地生長。因此不推薦在KM71中通過取代aox1:ARG4結構來獲得His轉化子。一般來說，如果是胞內表達，應盡量用Muts細胞，這樣得到的蛋白產物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多，使下游純化更易進行。而對于分泌蛋白的表達，無論是甲醇利用慢(Muts還是甲醇利用快(Mut+的

6、細胞都可應用。基因重組Pichia. pastoris酵母菌體內無天然質粒，所以表達載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達框架整合于染色體中以實現(xiàn)外源基因的表達，包括啟動子、外源基因克隆位點、終止序列、篩選標記等。細菌內同源重組被認為是重組質粒構建過程的難點，因為未線性化的環(huán)狀質粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低，所以重組轉移載體必須用特定的限制性內切酶進行線性化處理。這種處理的目的是防止隨機插入重組時質粒在功能區(qū)斷開，造成目的基因表達失活，讓同源重組以指定的方式發(fā)生。表達載體主要分為以下幾類：(1胞內表達載體主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pG

7、APZ、pGAPZa(Invitrogen等。該類載體可以將目的基因表達在胞內，可以避免畢赤酵母的糖基化，主要適合于那些不能被糖基化相關基因的表達；(2分泌型表達載體主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZ、pYAM75P等。由于畢赤酵母本身的泌內源蛋白非常少，將外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白質的純化及積累。常用的分泌的信號序列主要是由89個氨基酸組成的交配因子(-factor的引導；(3多拷貝插入表達載體如pPIC9K，pPIC3.5K。在某些情況下，畢赤酵母中重組基因多拷貝整合可增加所需蛋白的表達量。該載體均可用于在體內(pPIC3.5K, pPIC9K或體外(pAO815產生

8、并分離多拷貝插入，同時可檢測增加重組基因的拷貝數是否增加蛋白表達量。體內整合可通過高遺傳霉素抗性篩選可能的多拷貝插入，而體外整合可通過連接產生外源基因的串聯(lián)插入。在GS115中篩選His+Mut+轉化子：用SalI或StuI線性化質粒轉化GS115后，大多在His4位點上發(fā)生重組，大多數轉化子是Mut+表型；然而由于質粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位點發(fā)生重組，破壞野生型AOX1基因，產生His+Muts轉化子，則需要在MD及MM平板上檢測可證實His+ Mut+轉化子。線性化酶切位點插入事件GS115表型KM71表型SalI或StuI插入his4His+Mut+His+MutsSa

9、cI插入5AOX1His+Mut+His+MutsBglII取代AOX1His+MutsHis+Muts(不推薦畢赤酵母表達常用培養(yǎng)基10×YNB (13.4%的無氨基酸酵母氮源，134 g YNB固體溶于1L蒸餾水，過濾滅菌，4保存。YPD完全培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固體培養(yǎng)基含 1.5%瓊脂。轉化培養(yǎng)基RDB：每100mL加入山梨醇18 g (186 g/L，瓊脂糖2g (20g/L 121滅菌20分鐘，然后待溫度降至60以后在超凈臺上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L，10×葡萄糖10mL(20 g/

10、L，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L，100×AA 1mL?；靹颍蛊桨?滅菌時只加入 80ml水即可。選擇培養(yǎng)基MD(最小葡萄糖：配100mL，向80mL水中加入瓊脂糖2g(20 g/L121滅菌20分鐘，待溫度降至60以后在超凈臺上加入10×YNB 10mL(13.4 g/L，10×葡萄糖10mL(20 g/L，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L。選擇培養(yǎng)基MM(最小甲醇：配100mL，向90mL水中加入瓊脂糖2g(20 g/L 121滅菌20分鐘，待溫度降至60以后在超凈臺上加入10×Y

11、NB 10mL(13.4 g/L，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L，0.5mL甲醇(0.5%。誘導表達培養(yǎng)基BMGY：配1L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121滅菌20分鐘，然后待溫度降至60以后在超凈臺上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L，500×生物素1mL(4×10-4g/L，甘油10mL。誘導表達培養(yǎng)基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121滅菌20分鐘，然后待溫度降至60以后在超凈臺上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L，500×生物素1mL(4×10-4g/L，甲醇5mL。BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可穩(wěn)定分泌蛋白，阻止或減少分泌蛋白的分解。如果目的蛋白對中性PH蛋白酶敏感的話