化淤祛濕法對膝骨關(guān)節(jié)炎早期誘導(dǎo)型一氧化氮合酶炎癥途徑影響的實

1、化淤祛濕法對膝骨關(guān)節(jié)炎早期誘導(dǎo)型一氧化氮合酶炎癥途徑影響的實驗研究                       作者：段戡，袁長深，姚弘毅，劉宇翔，劉政治【摘要】  目的觀察化淤祛濕法對膝骨性關(guān)節(jié)炎早期誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）炎癥途徑的影響,探討其治療作用機理。方法通過切斷膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶造成膝OA模型。將24只日本雄性大耳白兔隨機分為A組（正常組）

2、、B組（模型組）、C組（補腎法）、D組（化淤祛濕法）。給藥4周后處死實驗兔，行關(guān)節(jié)腔大體觀察，關(guān)節(jié)液NO含量檢測，滑膜、關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察，滑膜、關(guān)節(jié)軟骨iNOS含量檢測。結(jié)果D組關(guān)節(jié)腔大體觀察與C組比較，差異無顯著性(P>0.05)；D組關(guān)節(jié)液NO含量檢測與C組比較，差異顯著(P<0.05)；D組滑膜、關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察評分與C組比較，差異顯著(P<0.05)；D組滑膜組織及軟骨中iNOS含量與C組比較有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論化淤祛濕法通過抑制膝OA早期NO及iNOS的表達，可降低NO及iNOS含量，減少軟骨細胞凋亡，促進軟骨基質(zhì)合成及抑制其分解，抑制滑膜炎

3、癥，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，促進了關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。 【關(guān)鍵詞】  膝骨關(guān)節(jié)炎 化瘀祛濕法 一氧化氮合酶膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（簡稱膝骨關(guān)節(jié)炎，KOA）是一種多發(fā)于老年人的慢性退行性疾病，目前無根治方法，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥（NSAIDs）為主對癥治療。而長期使用NSAIDs ，易發(fā)生胃腸道潰瘍等嚴重并發(fā)癥。臨床應(yīng)用化淤祛濕法或類似治法治療KOA取得了較好療效16。我們在兔KOA早期動物模型上，觀察了化淤祛濕法對誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）炎癥途徑的影響，以探討化淤祛濕法對KOA早期的治療作用及其機制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。1 材料1.1 分組  選擇成年健康日本雄性大耳白兔24

4、只（廣西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK桂2003-0001），體重2.02.5kg。按隨機數(shù)字表法隨機分成4組：A組（正常組）、B組（模型組）、C組（補腎法）、D組（化淤祛濕法），每組6只，分別編號。1.2 造模與處理 手術(shù)切斷膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶制造兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退行性變模型。采用化學(xué)純氨基甲酸乙酯（烏拉坦）麻醉，用0.9%鹽水將其配成25%的溶液，按1 g?kg-1體重（4 ml?kg-1體重）耳緣靜脈注射。麻醉后，剪除右后肢膝關(guān)節(jié)周圍毛發(fā)，常規(guī)消毒，髕旁內(nèi)側(cè)切口長約3 cm，切開關(guān)節(jié)囊，將髕骨向外翻轉(zhuǎn)，切斷前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶，止血，縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚。

5、A組不手術(shù)。4周以后喂服藥物1次/d，連續(xù)給藥4周。A組與B組喂服與D組中藥等量的淀粉顆粒1次/d。藥物組與劑量：C組：桑寄生15 g，補骨脂10 g，杜仲10 g，肉蓯蓉10 g，熟地10 g，鹿含草10 g，續(xù)斷15 g，山茱萸10 g；D組：丹參15 g，當歸10 g，川芎10 g，紅花10 g，川牛膝10 g，蒼術(shù)15 g，半夏10 g，陳皮10 g，白芥子6 g，白術(shù)10 g。為提高實驗結(jié)果的重復(fù)性，使用由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的單味中藥濃縮顆粒劑組配，并且要求同一批號。用藥劑量按Meeh-Rubner公式A(體表面積)=K(系數(shù))?W(體重g)2/3?10-4體表面積換算，用適量

6、溫開水將中藥濃縮顆粒劑攪拌均勻后灌胃。動物分籠標準飼養(yǎng)。于手術(shù)后8周予過量麻醉處死，處死當天不給藥。處死后每只動物依次打開關(guān)節(jié)腔行大體觀察。用銳刀切取內(nèi)側(cè)滑膜和股骨內(nèi)髁下面全層關(guān)節(jié)軟骨，留作實驗標本。滑膜、軟骨標本分成兩等份。2 方法2.1 關(guān)節(jié)腔大體觀察 實驗動物處死后，打開膝關(guān)節(jié)囊，觀察滑膜和軟骨表面的顏色、光澤、光滑度（是否粗糙）。2.2 關(guān)節(jié)液NO含量測定 打開膝關(guān)節(jié)囊后，收集關(guān)節(jié)滑液0.5 ml，用等量生理鹽水稀釋后，嚴格按南京建成生物研究所提供的NO測試盒（編號20071211）的實驗步驟行NO含量測定。2.3 組織學(xué)觀察 取材后的滑膜和軟骨標本經(jīng)4%

7、多聚甲醛溶液固定2448 h，遞增濃度乙醇脫水，石蠟包埋，與滑膜或軟骨表面垂直行間斷連續(xù)切片，厚3 m。HE染色、光鏡下組織學(xué)觀察。2.3.1 滑膜組織學(xué)觀察 觀察滑膜細胞、細胞外基質(zhì)、毛細血管。將滑膜病變定為4級，計分為03分?；ね暾?，細胞排列整齊，無充血水腫、無炎細胞浸潤為0級，計0分；滑膜充血水腫，表層細胞增生為級，計1分；滑膜細胞呈乳頭狀增生，滑膜內(nèi)血管增生，肉芽組織形成為級，計2分；滑膜內(nèi)肉芽組織纖維化（瘢痕形成），伴有淋巴細胞和漿細胞浸潤為級，計3分。2.3.2 軟骨組織學(xué)觀察 觀察的石蠟切片HE染色：觀察軟骨表面，細胞排列，基質(zhì)，潮線。按照賀艷麗等7標準，予

8、適當簡化，將軟骨退變定為4級，計分為03分。關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，可清楚地分為表層、移行層、輻射層和軟骨基質(zhì)鈣化層，輻射層和鈣化層之間的潮線清晰可見為0級，計0分；軟骨細胞排列不規(guī)則，層次變得紊亂為級，計1分；軟骨中層內(nèi)有軟骨細胞成簇增生，潮線間斷為級，計2分；關(guān)節(jié)軟骨表層灶性剝離，層次紊亂，潮線消失為級，計3分。2.4 滑膜、軟骨iNOS檢測 軟骨和滑膜組織中iNOS含量測定：剝?nèi)￡P(guān)節(jié)內(nèi)滑膜及關(guān)節(jié)軟骨，用1/10萬電子天平精確稱重，立即于低溫下(-83)放置，用研缽粗研后，用組織勻漿器做成組織勻漿，12 000 r/min離心后取上清液，嚴格按南京建成生物研究所提供的iNOS測試盒（編

9、號20071211）的實驗步驟行iNOS含量測定。2. 5 統(tǒng)計方法 本研究的數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS11.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計處理。3 結(jié)果3.1 滑膜和軟骨大體觀察A組兔膝關(guān)節(jié)軟骨外觀呈藍白色，色澤明亮，無裂紋及軟化缺損，觸之較硬；關(guān)節(jié)液量較少，質(zhì)地清轍透明。B組關(guān)節(jié)軟骨明顯失去原有光澤、發(fā)黃、色澤暗淡、軟骨觸之較軟，尤以股骨外髁為著，可見皸裂甚至缺損，關(guān)節(jié)表面欠規(guī)則，且關(guān)節(jié)邊緣有骨贅形成及纖維性粘連，滑膜存在不同程度增生；關(guān)節(jié)液量增多，且呈泡沫狀、混濁。對照、治療兩組均可見關(guān)節(jié)軟骨外觀呈白色，欠光滑，股骨髁軟骨觸之變軟，有的可見裂紋

10、，滑膜輕度增生，關(guān)節(jié)液較A組稍多。D組肉眼觀察與C組相似，滑膜炎性表現(xiàn)較B組輕，C，D組之間差異不顯著。3.2 關(guān)節(jié)液NO含量測定  見表1。關(guān)節(jié)液NO含量，B組與A組比較明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；C組及D組NO含量與A組比較無顯著性差異(P>0.05)，但與B組比較均明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)，且D組NO含量降低較C組明顯，有顯著性差異(P<0.05)。提示B組關(guān)節(jié)液NO含量顯著升高，使用補腎法和化淤祛濕法均可降低關(guān)節(jié)液NO含量，兩種藥物比較，化淤祛濕法作用更加明顯。百事通3.3 組織學(xué)觀察3.3.1 滑膜組織學(xué)觀察 見表

11、1?；そM織學(xué)計分，B組與A組比較明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；C組與A組比較有顯著性差異(P<0.05)，而與B組比較明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)；D組與A組比較無顯著性差異(P>0.05)，D組與B組比較有顯著性差異(P<0.05)，D組與C組比較有顯著性差異(P<0.05)。提示膝OA早期兔模型中，使用化瘀祛濕法和補腎法均有利于減小滑膜組織學(xué)計分，抑制滑膜炎癥；但兩種方法比較，化淤祛濕法作用更加明顯。3.3.2 關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察 見表1。關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)計分，B組與A組比較明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；C組

12、與A組比較有顯著性差異(P<0.05)，而與B組比較明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)；D組與A組比較無顯著性差異(P>0.05)，D組與B組比較有顯著性差異(P<0.05)，D組與C組比較有顯著性差異(P<0.05)。提示膝OA早期兔模型中，應(yīng)用化淤祛濕法和補腎法均可延緩關(guān)節(jié)軟骨退變；但兩種方法比較，使用化淤祛濕法更優(yōu)于補腎法。3.4 滑膜、軟骨iNOS的檢測  見表1。關(guān)節(jié)滑膜和軟骨iNOS含量，B組與A組比較明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；C組與A組比較有顯著性差異(P<0.05)，而與B組比較明顯降低，有顯著性差異(P&l

13、t;0.05)；D組與A組比較無顯著性差異(P>0.05)，D組與B組比較有顯著性差異(P<0.05)，D組與C組比較有顯著性差異(P<0.05)。提示膝OA早期兔模型中，使用化淤祛濕法和補腎法均可降低滑膜和關(guān)節(jié)軟骨iNOS的表達；但兩種方法比較，而使用化淤祛濕法更優(yōu)于補腎法。表1  關(guān)節(jié)液NO含量、滑膜和軟骨病變計分、軟骨和滑膜iNOS含量（略）關(guān)節(jié)液NO含量：B組與A組相比較，P<0.05；C組、D組與A組相比較，P0.05；C組、D組與B組相比較，P0.05；D組與C組相比較，P0.05；滑膜病變計分：B組與A組相比較，P0.05；C組與A組相比較，P0

14、.05；C組與B組相比較，P0.05；D組與A組相比較，P0.05；D組與B組，C組相比較，P0.05；軟骨病變計分：B組與A組比較，P0.05；C組與A組相比較，P0.05；C組與B組相比較，P0.05；D組與A組相比較，P0.05；D組與B組、C組相比較，P0.05；滑膜iNOS含量和軟骨iNOS含量：B組與A組相比較，P0.05；C組與A組相比較，P0.05；C組與B組相比較，P0.05，D組與A組相比較，P0.05；D組與B組、C組相比較，P0.05；n=64 討論中醫(yī)學(xué)認為，KOA多責之于虛實兩端，虛以肝腎脾虧虛等為主，實以血淤、痰濕阻滯等為主。病性為本虛標實。我們認為8，本病雖虛實

15、夾雜，證候復(fù)雜，但淤、濕（痰）等標實是造成KOA疼痛、腫脹等癥狀的主要原因， KOA的早期更是以實證為主，而虛證不突出。采用化瘀祛濕法治療早期KOA，切中中醫(yī)病機；即使兼有虛證，暫不治之，也符合中醫(yī)“急則治其標”原則。    研究發(fā)現(xiàn)，OA的發(fā)病與NO和iNOS密切相關(guān)。在正常滑膜中iNOS未見明顯表達9，OA時細胞因子如白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)等刺激下，使滑膜細胞表達iNOS增加，且iNOS強烈表達于沿膜襯里層、滑膜下層10。一旦iNOS蛋白合成，它的活性可持續(xù)表達，能催化產(chǎn)生大量NO，使NO水平升高，軟骨分解代謝增快，軟骨細胞凋亡過盛

16、，最致導(dǎo)終關(guān)節(jié)軟骨損害。因此，iNOS在OA的發(fā)病過中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示實驗各組關(guān)節(jié)液中NO含量明顯增高，也提示NO是OA軟骨退變的機制之一。在OA的早期，滑膜的增生和纖維化，分泌炎癥介質(zhì)和軟骨降解酶，且參與OA整個病理過程11，而且滑膜組織學(xué)改變與OA的臨床表現(xiàn)也呈現(xiàn)出相符性12。實驗顯示，使用化淤祛濕法可減少KOA早期關(guān)節(jié)液中NO的含量、滑膜和關(guān)節(jié)軟骨中iNOS的表達，顯著降低關(guān)節(jié)局部NO的含量，從而有利于抑制滑膜炎癥，緩解KOA早期的疼痛、腫脹癥狀，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。    本實驗表明，化淤祛濕法對兔KOA早期iNOS炎癥途徑產(chǎn)生重要作用，為化

17、淤祛濕法的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】  1陳廣禎,李心沁,梁安民.從瘀血痰濕論治膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎58例J.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,1998,1:30.2雷波,劉定安.從瘀血痰濕論治膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病48例臨床觀察J.湖南中醫(yī)雜志,1999,15(2):12.3嚴培軍,孫玉明,周福貽.從痰瘀水論治膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎176例J.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2000,16(4):249. 4金兌炫.運用化痰祛瘀法治療膝關(guān)節(jié)增生性關(guān)節(jié)炎50例J.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2003,19(2):119.5焦建鋒,鄭鵬.化瘀燥濕法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎196例療效觀察J.河南中醫(yī),2005,25(5):45.6惠?i華,孟祥奇,姜 宏.從痰濕瘀論治膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察J.中醫(yī)正骨,2007,19(2):12.7賀艷麗,楊曉紅,王韶進,等.玻璃酸鈉抑制骨關(guān)節(jié)固定造成的膝關(guān)節(jié)退行性改變的實驗研究J.中國生化藥物雜志,1997,18(1):12.8袁長深,段戡.從痰瘀論治骨性關(guān)節(jié)炎J.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008, 10(6):71.9裴明,曲綿域,于長隆.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和白介素-1受體拮抗劑在骨關(guān)節(jié)炎滑膜和軟骨中的表達及意義J.中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2000,19(3):246.10Grabowski PS, Wrigh