地錢愈傷組織的誘導(dǎo)及其細(xì)胞培養(yǎng)條件的建立

1、地錢愈傷組織的誘導(dǎo)及其細(xì)胞培養(yǎng)條件的建立         08-07-03 16:29:00     作者：尹德明，溫學(xué)森，婁紅    編輯：studa0714【摘要】  目的 探計對地錢愈傷組織的誘導(dǎo)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的條件。方法 用MSK2和MS培養(yǎng)基對地錢配子體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，運用模糊評判對MSK2培養(yǎng)基生長激素組合進(jìn)行綜合性狀評價。結(jié)果 MSK2和MS（2?mg/L 6BA）均能誘導(dǎo)出地錢愈傷組織，其中MSK2的誘導(dǎo)效果

2、較好。光照（3?0008?000 lux）能有效地促進(jìn)地錢愈傷組織生長。激素配比組合是0.5?mg/L 2,4D+2?mg/L NAA+2?mg/L 6BA適合于地錢細(xì)胞生長以及次生代謝生產(chǎn)。 結(jié)論 地錢愈傷組織的誘導(dǎo)成功和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件的建立，為探索藥用苔蘚植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)提供新的途徑以及對苔蘚植物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)提供新的理論指導(dǎo)。 【關(guān)鍵詞】  苔蘚；地錢；愈傷組織；植物細(xì)胞培養(yǎng)To induce callus tissues and establish suspension culture of Marchantia polymorpha L. Methods 

3、MSK2 and MS mediums were used to induce gametophytes into callus tissues, and the fuzzy comprehensive evaluation method was used to assess the optimal phytohormone combination. Results  Both MSK2 and MS (2?mg/L 6BA) mediums  could induce callus tissue formation, and the MSK2 medium was sup

4、erior to the MS medium for callus tissue induction. Light intensity（3?0008?000 lux） effectively promoted the callus tissue growth. Optimal phytohormone combination for cell growth and secondary metabolism production was 0.5?mg/L 2, 4D+2?mg/L NAA+2?mg/L 6BA. Conclusions  Successful induction of

5、the callus tissues and establishment of suspension culture of Marchantia polymorpha L. provide a new pathway for exploring the pharmaceutical moss to produce secondary metabolism and new theory guidance  for suspension culture of moss cells on a large scale.Key words: Bryophyte; Marchantia poly

6、morpha L.; Callus tissue; Cell culture 1  材料與方法1.1  實驗材料1.1.1  無菌材料獲得及愈傷組織誘導(dǎo) 實驗所用的地錢（Marchantia  polymorpha L.）配子體由本實驗室提供。將培養(yǎng)在溫室內(nèi)地錢上的濕沙洗掉，流水沖洗2?h，在無菌室內(nèi)用無菌濾紙吸干，剪成0.5?cm塊狀，放入7% NaClO消毒2?min，無菌水沖洗3次，于培養(yǎng)溫度為25?，光照時間12?h/d，光強(qiáng)為5?000?lux的條件下。采用MS、MS（2?mg/L 6BA）和MSK27作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均添加0

7、.9%瓊脂，在高溫滅菌前pH值調(diào)至5.8。1.1.2  懸浮培養(yǎng)條件的建立 懸浮細(xì)胞經(jīng)液體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)5代以上，作為細(xì)胞種子。選取MSK2、MS、KNOP、White、B5、Miller、1/2MSK2和1/2MS等用于篩選懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基，將篩選得到對細(xì)胞生長良好培養(yǎng)基進(jìn)行激素2,4D、NAA和 6BA（濃度0.5、1和2?mg/L）組合優(yōu)化，以求建立對細(xì)胞生長和次生代謝合成均為有利的懸浮培養(yǎng)條件。第20?d取樣進(jìn)行各生化指標(biāo)測定，重復(fù)3次。1.2  實驗方法1.2.1  光照強(qiáng)度的設(shè)定 將固體培養(yǎng)愈傷細(xì)胞置于培養(yǎng)溫度25?，光照時間12?h/d HPG350H

8、X智能型植物生長培養(yǎng)箱（黑龍江哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）內(nèi)，分別設(shè)定光照強(qiáng)度0、3?000、5?000和8?000 lux來考察光照對細(xì)胞生長的影響。1.2.2  pH的測定 采用PHS2型精密酸度計(上海雷磁儀表廠)測定。1.2.3  葉綠素(chlorophyll)含量的測定 采用丙酮乙醇混合液法測葉綠素含量8。將10?mL懸浮地錢細(xì)胞經(jīng)3?000?r/min離心后，置于6?mL丙酮和無水乙醇等比例混合浸提液中，放于暗處，室溫下進(jìn)行浸提，652?nm處測定光密度，葉綠素含量用mg/g或mg/L?表示。1.2.4  細(xì)胞膜通透性的測定 采用伊文思藍(lán)（Ev

9、ans blue）染色法9。取1?g鮮細(xì)胞，用0.5?mL 0.05%的伊文斯蘭溶液將細(xì)胞染色5?min后，PBS洗3次,以除去剩余染料，然后用含1% SDS（w/v）的50%（v/v）甲醇于50?下水浴30?min，以抽提藍(lán)色染料，在600?nm?下測定吸光值。1.2.5  酚類積累的測定 取2?mL培養(yǎng)基濾液，加入10?mL乙酸乙酯，超聲振蕩后靜止萃取2?h，取5?mL乙酸乙酯組分自然風(fēng)干后，殘留物溶于3?mL 75% 乙醇中，在280?nm下測量其吸光度，以3?mL 75% 乙醇為對照，以水楊酸為標(biāo)準(zhǔn)，以1?g水楊酸在280?nm處的吸光度代表一個單位的酚積累10。1.2.6&

10、#160; 生化指標(biāo)綜合評價 采用模糊隸屬法用多項指標(biāo)對激素配比組合進(jìn)行綜合評價：其中：U=U1，U2Un為評價因素集，Rij(i=1，2m；j=1，2n)為評價值，i為處理，j代表各生物學(xué)性狀。將各測得到的數(shù)據(jù)按公式Rij=(Rij-Rjmin)/(Rjmax-Rjmin)處理，Rjmin指J性狀中最小值；Rjmax指J性狀中最大值，得到評判模糊矩陣R。按照各性狀的重要性確立各因素的權(quán)重，得權(quán)重分配集A，使權(quán)重滿足歸一化要求ni=1Wi=1，通過矩陣運算 B= R·AT。1.3  統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以±s表示，應(yīng)用SAS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，采用t檢驗進(jìn)行顯

11、著性檢驗，以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2  結(jié)  果2.1  地錢愈傷組織的誘導(dǎo)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 見圖1。由圖1可見。MSK2培養(yǎng)基第15?d就可見在地錢配子體周圍已有深綠色愈傷組織產(chǎn)生，愈傷組織呈凝聚狀，不斷增多，并向培養(yǎng)基四周擴(kuò)展及培養(yǎng)基內(nèi)滲入，配子體不斷縮小而愈傷組織愈來愈多。同樣，培養(yǎng)在MS（2?mg/L 6BA）中的地錢配子體周圍也產(chǎn)生淺綠色的愈傷組織，只是其配子體縮小緩慢，愈傷細(xì)胞生物量沒有MSK2培養(yǎng)基多。而在MS培養(yǎng)基的配子體第20?d仍未見愈傷組織的產(chǎn)生。2.2  光強(qiáng)對地錢愈傷組織生長的影響 見表1。由表1可見，在光照3?000、5

12、?000和8?000?lux條件下，地錢愈傷細(xì)胞生物量顯著高于未光照條件下地錢愈傷細(xì)胞生物量（n=3, P0.05）。2.3  不同培養(yǎng)基對地錢懸浮細(xì)胞生長和葉綠素含量的影響  見表2。由表2可見，KNOP培養(yǎng)基細(xì)胞生物量最高，其次是MSK2，次之是MS培養(yǎng)基，而Miller等培養(yǎng)基的細(xì)胞生物量則要顯著低于上述3種培養(yǎng)基（n=3, P0.05）。其中稀釋培養(yǎng)基1/2MSK2和1/2MS培養(yǎng)基的細(xì)胞生物量則分別低于MSK2和MS培養(yǎng)基（n=3, P0.01）。    MSK2培養(yǎng)基生物量高于除KNOP外的其他培養(yǎng)基，其葉綠素含量3.93?g/L高于KNOP、Miller和MS等培養(yǎng)基（n=3, P0.05）。另外，MSK2培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織的效果比MS（2?mg/L 6BA）培養(yǎng)基要好（圖1），因此本研究在MSK2培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，對其激素2,4D、NAA和 6BA進(jìn)行不同比例組合優(yōu)化，以求建立對細(xì)胞生長和次生代謝生產(chǎn)都較為有利的培養(yǎng)條件。2.4  不同激素組合對地錢細(xì)胞生長及次生代謝的影響 見表3。由表3可見，表中序號1和3細(xì)胞生物量高于序號10 MSK2（n=3, P0.05），序號6、7、8和9要低于序號10（n=3, P0.05），而序號2、4和5細(xì)胞生物量與序號10沒有區(qū)別。同樣，對于葉綠素含