動物細胞融合與單克隆抗體

1、2.2.2 動物細胞融合與單克隆抗體問題探討問題探討 “番茄馬鈴薯”（理想圖） 通過長期的實驗，科學(xué)家們通過長期的實驗，科學(xué)家們采用體細胞雜交技術(shù)獲得了采用體細胞雜交技術(shù)獲得了“番番茄茄馬鈴薯馬鈴薯”植株。植株。如果將奶牛的細胞與植物細胞雜交，得到綠色的小奶牛，那豈不是只要曬曬太陽就可以擠出牛奶嗎？動物細胞也能融合嗎？請同學(xué)們閱讀課本P52動物融合 動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程，融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞稱為雜交細胞雜交細胞。一、動物細胞融合一、動物細胞融合 細胞融合是正常的生命活動細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合兩個

2、細胞正在融合 受精作用受精作用 動物細胞融合過程示意圖動物細胞融合過程示意圖不同DNA的兩個細胞 滅活的病毒有絲分裂兩個完整的雜交細胞細胞融合與融合誘導(dǎo)細胞融合物質(zhì)：細胞融合與融合誘導(dǎo)細胞融合物質(zhì)： 因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合，不滅質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合，不滅活的話會感染細胞，而不能誘導(dǎo)細胞融合。活的話會感染細胞，而不能誘導(dǎo)細胞融合。 細胞融合技術(shù)應(yīng)用于哪些方面？細胞融合技術(shù)應(yīng)用于哪些方面？ 細胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)及制備單克隆抗體。細胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)及制備單克隆抗體。滅活病毒

3、誘導(dǎo)細胞融合的原理：n病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。n滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。思考題思考題1.植物體細胞雜交時首先應(yīng)用什么方法去掉細胞壁？ 酶解法，如纖維素酶或果膠酶2.動物細胞融合時需要進行去壁處理嗎？為什么？無需，因為動物細胞無細胞壁3.植物體細胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？離心、電激等物理方法；PEG等化學(xué)方法4.動物細胞融合能利用上述兩類方法嗎？還有其他方法嗎？能 還可以利用滅活的病毒進行誘導(dǎo)6.你推測一下動

4、物細胞融合有哪些方面的應(yīng)嗎？思考題思考題 利用動物細胞融合技術(shù)誘導(dǎo)形成雜交瘤細胞7.在生產(chǎn)實際中雜交瘤細胞有怎樣的應(yīng)用？ 生產(chǎn)單克隆抗體5.植物體細胞雜交應(yīng)先進行原生質(zhì)體的融合再進行組織培養(yǎng)形成完整的雜種個體，動物細胞融合后能形成雜種動物個體嗎？不能主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株主要用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振動、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細胞分散后誘導(dǎo)細胞融合去除細胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合 細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性細胞融合的原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目植物體細胞雜交與動物細胞融合的比較提問？1.抗體是由何種細胞產(chǎn)生的

5、？ 效應(yīng)B細胞（漿細胞）。2.一個淋巴細胞(漿細胞)能分泌多種抗體嗎？ 每一個淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。3.一種抗原侵入機體之后，引起機體免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體只有一種嗎？ 動物在免疫反應(yīng)過程中，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上。4. 簡述獲得抗體的傳統(tǒng)途徑？ 抗原 動物體 抗體 抗原不純 抗體不純二、單克隆抗體二、單克隆抗體刺激漿細胞B B淋巴細胞與抗體的關(guān)系：淋巴細胞與抗體的關(guān)系：B B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。生抗體。動物體內(nèi)的動物體內(nèi)的B B淋巴細胞可以產(chǎn)生百淋巴細胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原萬種以上的抗體，每種抗體對特

6、定的抗原具有特異性免疫作用。具有特異性免疫作用。每一個淋巴細胞只能產(chǎn)生一種抗每一個淋巴細胞只能產(chǎn)生一種抗體。體。所以傳統(tǒng)的抗體的生產(chǎn)方法及缺陷是什么？所以傳統(tǒng)的抗體的生產(chǎn)方法及缺陷是什么？怎樣解決這個問題？怎樣解決這個問題？6.如何獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體？ 體外培養(yǎng)單個淋巴細胞，提取分泌的抗體7.體外培養(yǎng)淋巴細胞能無限增殖嗎?怎樣解決這個問題？5.這種方法獲得的抗體有什么缺陷？ 產(chǎn)量低，純度低，特異性差1.設(shè)計方案：一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細胞能夠無限增殖雜種細胞二、單克隆抗體二、單克隆抗體2.制備過程：如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？n利用淋巴細

7、胞產(chǎn)生抗體的功能利用淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能n利用腫瘤細胞無限增殖的特性利用腫瘤細胞無限增殖的特性n利用細胞融合的技術(shù)將利用細胞融合的技術(shù)將兩種細胞融兩種細胞融合合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的性的雜交瘤細胞雜交瘤細胞n利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細胞交瘤細胞如何篩選？如何篩選？融融合合方方式？式？ 單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程 注射抗原注射抗原B淋巴細胞淋巴細胞骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選細胞融合、篩選雜交瘤細胞雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞

8、群特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體免疫小鼠培養(yǎng)骨髓瘤細胞融合骨髓瘤細胞B淋巴細胞注射特定抗原蛋白選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)專一抗體檢驗陽性專一抗體檢驗陽性注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體單克隆抗體克隆雜交細胞分開不同雜交細胞，克隆專一抗體，檢驗陽性細胞 單克隆抗體制備過程示意圖單克隆抗體制備過程示意圖多種雜交細胞2022-2-6.19要要點解讀點解讀 ( (1)1)誘導(dǎo)融合的誘導(dǎo)融合的2 2種細胞名稱及作用種細胞名稱及作用 免疫過的免疫過的B B淋巴細胞淋巴細胞( (漿細胞漿細胞)產(chǎn)生抗體產(chǎn)生抗體; ; 骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞無限增殖。無限增殖。 (2) (

9、2)誘導(dǎo)融合與原生質(zhì)融合的不同方法誘導(dǎo)融合與原生質(zhì)融合的不同方法 動物細胞誘導(dǎo)融合的特有方法動物細胞誘導(dǎo)融合的特有方法滅活病滅活病毒誘導(dǎo)。毒誘導(dǎo)。 2022-2-6.20(3)2(3)2次篩選的目的及方法次篩選的目的及方法n在特定的選擇性培養(yǎng)基上在特定的選擇性培養(yǎng)基上, ,未融合的親本細胞未融合的親本細胞n ( (漿細胞和骨髓瘤細胞漿細胞和骨髓瘤細胞) )和融合的具有同種核的細和融合的具有同種核的細胞胞(BB(BB融合細胞、瘤瘤融合細胞融合細胞、瘤瘤融合細胞) )都會死亡都會死亡, ,只有融只有融n合的雜種細胞合的雜種細胞( (雜交瘤細胞雜交瘤細胞) )才能生長。這種雜種才能生長。這種雜種n細

10、胞的特點是既能迅速大量繁殖細胞的特點是既能迅速大量繁殖, ,又能產(chǎn)生單一的又能產(chǎn)生單一的特異性抗體。特異性抗體。2022-2-6.21 經(jīng)選擇性培養(yǎng)的雜交瘤細胞并非都是能分經(jīng)選擇性培養(yǎng)的雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞泌所需抗體的細胞( (很多種雜交瘤細胞很多種雜交瘤細胞),),需經(jīng)克需經(jīng)克隆化培養(yǎng)和抗體檢測隆化培養(yǎng)和抗體檢測, ,經(jīng)多次篩選后就可獲得足經(jīng)多次篩選后就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞。夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞。 (4)2(4)2個培養(yǎng)提取場所個培養(yǎng)提取場所 體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)培養(yǎng)液提取。培養(yǎng)液提取。 體內(nèi)小鼠腹腔中培養(yǎng)體內(nèi)小鼠腹腔中培養(yǎng)小鼠腹水中提取。小鼠腹水中提取

11、。3.單克隆抗體的應(yīng)用： 在基礎(chǔ)理論研究中具有重要意義 在疾病診斷、治療和預(yù)防方面，具有 生物導(dǎo)彈二、單克隆抗體特異性強、靈敏度高 等優(yōu)越性。3 3、單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體的應(yīng)用與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。性強，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。應(yīng)用主要有：應(yīng)用主要有：1 1、臨床診斷、臨床診斷2 2、作為載體，運載抗癌藥物，形成、作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”治療腫瘤治療腫瘤資料資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、

12、免疫性疾病、血液病、體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)位體內(nèi)“病灶病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。蹤及心肌梗塞的診斷。用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，靈敏度很高，在妊娠第8天就可以做出診斷，比原來的診斷方法提前了10天左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而

13、對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90以上。2022-2-6.26 提醒提醒 取相應(yīng)取相應(yīng)B B細胞前必需先注射相應(yīng)抗原細胞前必需先注射相應(yīng)抗原, ,形象形象 地說先地說先“打針打針”, ,否則失敗。否則失敗。 (5)(5)原理：細胞膜的流動性和細胞增殖。原理：細胞膜的流動性和細胞增殖。 拓展提升拓展提升 植物體細胞雜交和單克隆抗體的制備的比較植物體細胞雜交和單克隆抗體的制備的比較2022-2-6.272022-2-6.28知識結(jié)構(gòu)兩個過程動物細胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導(dǎo)細胞融合的新方法 滅活的病毒一個新細胞雜交瘤細胞一個優(yōu)勢單克隆抗體特異性 強、靈敏度高的優(yōu)勢1.植

14、物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)有什么不同？2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞？提示：植物體細胞雜交技術(shù)與動物細胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細胞融合前需去掉細胞壁，然后再融合；動物細胞融合是兩個體細胞直接融合。 提示：哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細胞，B淋巴細胞 能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細胞大量增殖。B淋巴細胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖

15、，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞，它會兼有兩個親本細胞的特性在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。 教學(xué)參考教學(xué)參考1.已成功的動物細胞融合實例還有哪些？ 生物種類 細胞來源 成功年代 酵母菌雞 原生質(zhì)體血紅細胞 1975年人胡蘿卜 腹水癌細胞原生質(zhì)體 1976年人小鼠 纖維肉瘤細胞畸胎瘤細胞 1978年要知道更多的實例，需經(jīng)常查閱更多科研報道。2.為什么不用兩個而要用多個細胞進行動物細胞間的融合？ 就目前常用的細胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細胞融合，其效率太

16、低，不一定能得到融合細胞。更重要的是，即使兩個細胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細胞類型。目前動物細胞融合技術(shù)最有價值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。我們知道，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達百萬種以上，但是每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個脾細胞（含B淋巴細胞）和一個瘤細胞雜交，我們不能確定該脾細胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細胞和瘤細胞進行融合，就可以從融合細胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。3.如何進行雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？ 融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交

17、瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行34次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。教學(xué)反饋1.動物細胞融合技術(shù)最重要的用途是 （ ）B2.單克隆抗體是由下列哪種細胞產(chǎn)生的（ ）A.B淋巴細胞 B.T淋巴細胞 D3.（多選）1975年米爾斯坦和柯勒成功地獲得了單克隆抗

18、體。下列細胞中與單克隆抗體的制備有關(guān)的是（ ）A.效應(yīng)B細胞 BT淋巴細胞C.骨髓瘤細胞 D雜交瘤細胞 A B C DB B體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞足夠數(shù)量的細胞群足夠數(shù)量的細胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C 4.下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的實驗方案制備單克隆抗體不能，沒有將抗原注入小鼠體內(nèi)，無法獲得產(chǎn)生單一抗體的B淋巴細胞。(1).該實驗方案的目的是：_(2).該方案能達到預(yù)期效果嗎？為什么？(3).A是從小鼠的脾臟中取得_ 該細胞能夠產(chǎn)生_ 。(4).圖中B為_過程，常用_作為誘導(dǎo)劑，該細胞繼承_的遺傳特性，既能_,又能_。(5).C過程指細胞培養(yǎng)，該過程包括_培養(yǎng)和_培養(yǎng)兩個階段，其中_代以內(nèi)的的細胞屬于細胞株。B淋巴細胞抗體細胞融合滅活的病毒雙親細胞分泌抗體無限增殖原代傳代50課后習(xí)題課后習(xí)題1. 單克隆抗體制備過程