異丙嗪對(duì)家兔EGTA性發(fā)熱的解熱作用及其機(jī)制研究

1、    異丙嗪對(duì)家兔EGTA性發(fā)熱的解熱作用及其機(jī)制研究王彥平王華東陳小琳陸大祥李楚杰顏亮 摘要目的：觀察異丙嗪(promethazine,PMZ)對(duì)家兔EGTA性發(fā)熱的影響并探討其作用機(jī)制。方法：側(cè)腦室和靜脈給藥。用Fura2熒光分光光度法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度(Ca2i)。結(jié)果：(1)側(cè)腦室灌注0.6 mol EGTA引起家兔明顯的發(fā)熱反應(yīng)，側(cè)腦室灌注0.6 mol EGTA 20 min 后，靜脈注射PMZ(5 mg/kg)明顯抑制EGTA引起的結(jié)腸溫度上升，其3 h發(fā)熱反應(yīng)指數(shù)明顯低于側(cè)腦室灌注0.6 mol EGTA 20 min后靜脈注射生理鹽

2、水(NS)組。而側(cè)腦室灌注人工腦脊液(ACSF)20 min后靜脈注射PMZ(5 mg/kg)組家兔結(jié)腸溫度明顯低于ACSFNS對(duì)照組。(2)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，向下丘腦細(xì)胞懸液中加入終濃度為0.74 mmol/L的PMZ，下丘腦細(xì)胞Ca2i從(159.2±18.8)nmol/L升高到(533.7±90.1)nmol/L(P0.05)。 結(jié)論：PMZ誘導(dǎo)體溫調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)細(xì)胞Ca2i升高可能是PMZ抑制家兔EGTA性發(fā)熱的中樞機(jī)制之一。 主題詞依他酸；發(fā)熱；鈣；異丙嗪 The antipyretic effect of promethazine on egtazic acid-in

3、duced fever in rabbits WANG Yan-Ping,WANG Hua-Dong,LU Da-Xiang,CHEN Xiao-Lin,LI Chu-Jie,YAN Liang Dept.of Pathophysiology,Jinan University Medical College,Guangzhou(510632) AbstractAIM：To investigate the effect of promethazine(PMZ)on egtazic acid-induced fever in rabbits and its mechanism.METHODS:Eg

4、tazic acid was administrated intracerebroventricularly,PMZ was given intravenously.Free Ca2 intracellular concentrations(Ca2i)was measured by Fura-2 fluorometry.RESULTS:(1)0.06 mol egtazic acid intracerebroventricularly infused induced a rise in colonic temperature,when PMZ(5 mg/kg) was administrate

5、d intravenously 20 min after the infusion of egtazic acid,it reduced the febrile responses of rabbits to egtazic acid significantly (0.06 mol) but without complete suppression.PMZ administrated alone caused a marked decrease in colonic temperature.(2)PMZ (0.74 mmol/L) increased Ca2i in hypothalamus

6、cells from(159.2±18.8)nmol/L to(533.7±90.1)nmol/L (P0.05).CONCLUSION：PMZ possesses antipyretic effect on egtazic acid-induced fever in the rabbit and raises the possibility that the antipyretic actions of PMZ are mediated through the increase of Ca2i incuced by PMZ. MeSHEgtazic acid;Fever;

7、Calcium;Promethazine 組胺H1受體阻斷劑異丙嗪(promethazine,PMZ)是一種常用的抗過敏藥物，它具有降低正常體溫和抑制家兔內(nèi)毒素性發(fā)熱的作用1，2，但其降溫機(jī)制尚不清楚。一些學(xué)者強(qiáng)調(diào)Ca2濃度是體溫調(diào)定點(diǎn)的生理學(xué)基礎(chǔ)，并認(rèn)為其敏感區(qū)位于后下丘腦3。我們的研究發(fā)現(xiàn)4，向家兔側(cè)腦室灌注EGTA，降低中樞Ca2濃度，可引起家兔明顯的發(fā)熱反應(yīng)。然而，異丙嗪對(duì)家兔EGTA性發(fā)熱有何影響?其降溫機(jī)制是否與中樞鈣代謝有關(guān)?迄今未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在觀察PMZ對(duì)家兔EGTA性發(fā)熱反應(yīng)及家兔下丘腦細(xì)胞Ca2i的影響。 材料與方法 一、試驗(yàn)試劑和主要儀器： 人工腦脊液(ar

8、tificial cerebrospinal fluid,ACSF)按文獻(xiàn)方法配制4。EGTA(ethylene glycol bis(2-aminothyl-ether)tetraacetic acid)，分析純，美國(guó)Feinbiochemica Heidelberg公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)時(shí)用ACSF配制成4 mmol/L(pH 7.4)。胰蛋白酶、Fura2AM(用DMSO溶成1 mmol/L后，置20 避光保存?zhèn)溆?、Triton X100、trypan blue、鹽酸異丙嗪均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器有RF5000型熒光分光

9、光度計(jì)(日本 Shimadzu)、3000型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Sheldon)、HL2型電子微量恒流泵(上海滬西儀器廠)和WRYB型微機(jī)熱原測(cè)溫儀(上海黃海儀器廠)。 二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 健康封閉群新西蘭兔20只由本院動(dòng)物所提供，體重2.02.7 kg，雌雄不拘，單籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)室溫度保持在2123 。實(shí)驗(yàn)前，家兔置于特制的兔架上，用模擬測(cè)溫探頭的導(dǎo)管經(jīng)肛門插入10 cm并固定在尾根部，每天4 h，適應(yīng)3 d，第4 d開始實(shí)驗(yàn)。 三、體溫測(cè)定： 實(shí)驗(yàn)時(shí)，將測(cè)溫探頭經(jīng)肛門插入10 cm并固定在尾根部，待體溫穩(wěn)定后，用與測(cè)溫探頭相連的WRYB型微機(jī)熱原測(cè)溫儀測(cè)定家兔結(jié)腸溫度3次(每10

10、min 1次)，取均數(shù)作為基礎(chǔ)體溫，側(cè)腦室灌注后每10 min測(cè)定家兔結(jié)腸溫度1次，連續(xù)觀察3 h。 四、側(cè)腦室插管： 參照文獻(xiàn)所描述的方法4，5，在兔頭顱骨APO L45，APO R45處鉆孔，將外徑為1 mm的塑料導(dǎo)管插入H5水平，用牙科粘固粉將塑料導(dǎo)管固定在顱骨上，并加熱封閉塑料導(dǎo)管的上端，縫合切口，術(shù)后肌注青霉素(2萬(wàn)U/kg)3 d。第6 d挑選健康的家兔在清醒的情況下進(jìn)行側(cè)腦室灌注實(shí)驗(yàn)。 五、下丘腦細(xì)胞Ca2i測(cè)定： (一)下丘腦細(xì)胞懸液制備及Frua2AM負(fù)載：參照文獻(xiàn)所述的方法4，6，迅速斷頭處死家兔，取下丘腦組織置冰冷的Hepes緩沖的Hanks液(mmol/L：Hepes

11、20,NaCl 137，KCl 5.0，KH2PO4 0.4,Na2HPO4 0.6，NaHCO3 3.0，CaCl2 1.3，MgSO4 0.4，MgCl2 0.5 ，glucose 5.6；pH7.4)中除去血管和殘留血液，轉(zhuǎn)入含0.5 mL冰冷Hepes緩沖的Hanks液的燒杯中剪碎后再移入試管，加適量0.125%的胰酶，置37培養(yǎng)箱中20 min。用0.5 mL冰冷的DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清)終止消化，經(jīng)200目過篩后1500 rmin 離心5 min，去上清液，沉淀用DMEM培養(yǎng)基懸浮。取少量的細(xì)胞懸液用臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率在95%以上，調(diào)整

12、細(xì)胞密度為1×109個(gè)L。在上述細(xì)胞懸液中加入Fura2AM(終濃度為5 mol/L)后，將細(xì)胞懸液置于5%CO2培養(yǎng)箱中，在37 恒溫下孵育50 min。負(fù)載后的細(xì)胞用Hepes緩沖的Hanks液洗3次。用2.5 mL Hepes緩沖的Hanks 液懸浮細(xì)胞備用。 (二)熒光測(cè)定6：采用RF5000型熒光分光光度計(jì)，其激發(fā)光柵為5 nm，發(fā)射光柵為10 nm。首先掃描測(cè)定Fura2AM標(biāo)準(zhǔn)液、負(fù)載液及Fura2AM與細(xì)胞懸液溫育后的細(xì)胞懸液的熒光光譜。Fura2AM進(jìn)入細(xì)胞水解成Fura2后與Ca2結(jié)合，其激發(fā)波長(zhǎng)從380 nm移至340 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)仍為500 nm。達(dá)到上

13、述要求后，觀察不同實(shí)驗(yàn)條件下熒光強(qiáng)度的變化，用計(jì)算機(jī)按下式計(jì)算Ca2i：Ca2ik（d）×（FFmin)（FmaxF）。其中，k（d）為Fura2與Ca2反應(yīng)的解離常數(shù)(224 nmol/L)；F為不同實(shí)驗(yàn)條件下的熒光值，F(xiàn)min為最小熒光值；Fmax為最大熒光值。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先測(cè)定靜息狀態(tài)下和加入各種影響因素后的F值，然后加入濃度為0.1% Triton X100 測(cè)定Fmax，加入終濃度為4 mmol/L EGTA測(cè)定Fmin。并在計(jì)算前對(duì)細(xì)胞自發(fā)熒光的影響進(jìn)行校正。 六、實(shí)驗(yàn)步驟和分組： (一)用18只家兔進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)，觀察PMZ對(duì)家兔EGTA性發(fā)熱的影響。家兔隨機(jī)分4組：ACSF

14、NS組、ACSFPMZ組、EGTANS組和EGTAPMZ組，實(shí)驗(yàn)時(shí)，用HL2型電子微量恒流泵向側(cè)腦室灌注ACSF150 L或EGTA(4 mmol/L)150 L，20 min后，經(jīng)兔耳緣靜脈注射PMZ 1 mLkg(5 gL)或生理鹽水(normal Saline,NS)1 mL/kg。 (二)用2只家兔制備下丘腦細(xì)胞懸液，觀察PMZ對(duì)下丘腦細(xì)胞Ca2i的影響 七、體溫反應(yīng)指標(biāo)及數(shù)據(jù)處理： 體溫反應(yīng)指標(biāo)用平均體溫反應(yīng)曲線，3 h發(fā)熱反應(yīng)指數(shù)(3 h thermal response index,TRI3）表示。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用Studen'

15、;s t檢驗(yàn)判斷均數(shù)差異的顯著性。 結(jié)果 一、PMZ對(duì)家兔EGTA性發(fā)熱的影響： 如圖1和表1所示，側(cè)腦室灌注ACSF，20 min后靜脈注射生理鹽水組，家兔體溫沒有明顯的改變。而ACSFPMZ組家兔體溫明顯下降。EGTANS組TRI3明顯高于ACSFNS組(P0.05)。側(cè)腦室灌注0.6 mol EGTA20 min后靜脈注射PMZ(5 mg/kg)組TRI3明顯低于EGTANS組(P0.05)。 表1各組家兔3 h發(fā)熱反應(yīng)指數(shù) Tab 1Three-hours thermal response index(TRI3）of rabbits in groups(±s) Group n

16、 TRI3 ACSFNS 3 0.88±1.27 ACSFPMZ 4 7.33±5.48* EGTANS 6 20.58±6.43* EGTAPMZ 5 6.72±1.45* *P0.05,vs ACSFNS group；P0.05，vs EGTANSgroup Fig 1Effect of promethazine(iv) on the EGTAinduced fever in rabbits 圖1靜脈注射PMZ對(duì)家兔EGTA性發(fā)熱反應(yīng)的影響 二、PMZ對(duì)家兔下丘腦細(xì)胞Ca2i的影響： 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，向下丘腦細(xì)胞懸液中加入50 mmol/L KCl，細(xì)胞C

17、a2i從(107.7±4.6)nmol/L 升高到(194.1±10.3)nmol/L(P0.05)。如圖2所示，向下丘腦細(xì)胞懸液中加入2 mol的PMZ(終濃度為0.74 mmol/L)，引起Fura2負(fù)載的下丘腦細(xì)胞熒光比率(340 nm380 nm)明顯上升，顯示PMZ引起下丘腦細(xì)胞Ca2i明顯增高，下丘腦細(xì)胞Ca2i從(159.2±18.8)nmol/L升高到(533.7±90.1)nmol/L(P0.05)。 討論 Palmi等觀察到側(cè)腦室注射鈣通道阻斷劑異搏定和nifedipine引起家兔體溫明顯升高，事先給予乙酰水楊酸明顯抑制異搏定誘導(dǎo)的這

18、種升溫反應(yīng)，與此相反，側(cè)腦室注射鈣通道激動(dòng)劑BAYK8644卻引起家兔體溫明顯降低。提示鈣通道阻斷劑的作用部位是體溫調(diào)節(jié)中樞的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元的體溫調(diào)節(jié)功能與鈣代謝密切相關(guān)7。我們先前的研究表明4，側(cè)腦室灌注EGTA絡(luò)合中樞Ca2進(jìn)而降低下丘腦神經(jīng)細(xì)胞Ca2i導(dǎo)致下丘腦cAMP增高是家兔EGTA性發(fā)熱的中樞機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射PMZ能明顯抑制家兔EGTA性發(fā)熱，而且體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察到，PMZ可引起下丘腦細(xì)胞Ca2i明顯增高，結(jié)合先前的研究4，7，這些結(jié)果提示PMZ誘導(dǎo)體溫調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)細(xì)胞Ca2i增高可能是PMZ抑制家兔EGTA性發(fā)熱的中樞機(jī)制之一。Palmi等曾報(bào)道7，側(cè)腦室注射鈣通

19、道激動(dòng)劑BAYK8644不僅可降低家兔正常體溫，而且抑制家兔ET性發(fā)熱。如前所述，PMZ可引起家兔下丘腦細(xì)胞Ca2i明顯增高，而且具有降低正常體溫和抑制ET性發(fā)熱的作用，因此我們推測(cè)，PMZ抑制ET性發(fā)熱的機(jī)制也可能與PMZ誘導(dǎo)體溫調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)細(xì)胞Ca2i增高有關(guān)。新近，Tanaka等發(fā)現(xiàn)8。PMZ可阻斷心肌細(xì)胞Na內(nèi)流，PMZ對(duì)體溫調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)細(xì)胞是否有這種作用，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。 Fig 2Effect of promethazine on fluorescence ratios (340 nm/380 nm) in Fura2filled hypothalamus cells.()shows addition of 2 mol promethazine 圖2PMZ對(duì)負(fù)載Fura2的下丘腦細(xì)胞熒光比率(340 nm/380 nm)的影響 作者單位：暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室(廣州510632) 參考文獻(xiàn) 1王德成.解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥.王煥斗.主編.應(yīng)用藥理學(xué).貴陽(yáng)：貴州人民出版社，1984.179. 2付詠梅，陳小琳，陸大祥，等.異丙嗪對(duì)家兔內(nèi)毒素性發(fā)熱及血清SOD和MDA含量的影響.中國(guó)病理生理雜